外显子测序
外显子组测序(exome-seq)是对定向富集的基因组DNA进行高通量测序,它能够以相对低的费用对人类外显子组进行拷问。2009年,实时荧光定量pcr,外显子组捕获工具的出现,让外显子组测序这种技术迅速红起来。到目前为止,已有超过1万个外显子组被测序。
如今有多家公司推出了外显子组捕获试剂,包括罗氏NimbleGen、安捷伦、Illumina,还有现在的华大基因。这些方法究竟孰优孰劣,斯坦福大学医学院遗传学系的研究人员对市场上三个主流的外显子组测序平台进行了比较。该研究结果发表在《Nature Biotechnology》上。研究人员利用安捷伦、Illumina和NimbleGen的外显子组测序平台对同一个人类血液样品进行分析。他们的结 果表明,NimbleGen平台作为一个使用高密度重叠探针的平台,尽管覆盖了较少的基因组区域,但在灵敏检测小的变异时所需的测序量也少。在同样获得80M测序数据的情况下,陕西pcr,NimbleGen有97%的目标序列达到10x以上的测序深度,而其他产品只有90%。而安捷伦和Illumina的探针能够在低密度下捕获更多数量的变异。此外,Illumina还捕获了未翻译的区域,这是NimbleGen和安捷伦平台无法靶定的。研究人员还比较了同一样品的外显子组测序和全基因组测序(WGS),显示外显子组测序能够检测到WGS错过的小变异。
除了文中提到了三个主流平台,外显子组捕获方面的新产品也在不断推出,研究人员的选择也将更广泛。罗氏NimbleGen即将推出新一代的外显子液相捕获产品。这一新产品将可捕获64M的基因组序列,包括外显子以及miRNA,基因检测怎么做,它含与其他NimbleGen液相捕获产品相同的2.1M高密度探针,以高xiao、均一、特异、的定向捕获。
分子实验介绍——印迹(Western blot)检测
通过SDS-PAGE凝胶将细胞或生物样品内的蛋白按照蛋白分子量从大到小规律分离开。经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如纤维素薄膜或PVDF膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的起反应,再与酶或同位素标记的第二起反应(目前主要用HRP标记的第二),经过底物显色或自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分(目前主要使用鲁米诺和二抗中的HRP反应发出荧光,通过仪器或者胶片显色)。该技术广泛应用于检测蛋白水平的表达。
实验流程:细胞收集-细胞裂解,蛋白提取-蛋白变性-SDS-PAGE电泳-蛋白质转膜印记-蛋白封闭-目的孵育-二抗孵育-显色拍照
结果示例:
图 A不同大小的质粒转染细胞后,Western blot检测图片;B A蛋白不同培养时间后Western blot检测图片;C 使用Image pro plus软件对A蛋白灰度检测,A蛋白表达变化统计图
RNA pull down 检测
RNA pull down:RNA沉淀检测,荧光定量pcr,是检测RNA结合蛋白与其靶RNA之间相互作用的主要实验方法之一。使用体外转录将RNA进行生物素标记,并与细胞蛋白裂解液孵育,形成RNA-蛋白复合物。复合物通过磁珠结合后分离,复合物纯化洗脱后通过Western blot验证检测特性的蛋白。若筛选可能结合的蛋白通过质谱实验进行检测筛选。

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