试剂准备
1X测定/裂解缓冲液：短暂混合5X储备液，并在去离子水中稀释至1X。 在使用前，添加蛋白酶抑制l剂，例如1 mM PMSF，10 μg / mL亮肽素和10 μg / mL抑肽酶。
1.将细胞（一块10厘米长的平板，约107个细胞）培养至约80-90％汇合。根据需要用活化剂或抑制l剂刺激细胞。
2.吸出培养基，并用
Rab7 蛋白
试剂准备
1X测定/裂解缓冲液：短暂混合5X储备液，并在去离子水中稀释至1X。 在使用前，添加蛋白酶抑制l剂，例如1 mM PMSF，10 μg / mL亮肽素和10 μg / mL抑肽酶。
1.将细胞（一块10厘米长的平板，约107个细胞）培养至约80-90％汇合。根据需要用活化剂或抑制l剂刺激细胞。
2.吸出培养基，并用冰冷的PBS洗涤两次。
3.完全除去PBS洗涤液，然后向细胞中加入冰冷的1X分析/裂解缓冲液（每10 cm组织培养板0.5-1 mL）。
4.将培养板放在冰上10-20分钟。
5.用刮板将其从平板上取下。
6.将裂解物转移至适当大小的试管中，并置于冰上。
7.如果发生核裂解，则细胞裂解液可能变得非常粘稠，难以移液。如果发生这种情况，可将裂解液通过27号注l射器针头3-4次以剪切基因组DNA。
8.通过离心10分钟（在4°C下为12,000 x g）清除裂解物。
9.收集上清液并将样品（约1-2 mg的总蛋白）存储在冰上以立即使用，或速冻并存储在-70°C以便将来使用。
阳性对照和阴性对照的体外GTPγS/ GDP蛋白质上样量
注意：体内细胞刺激将激l活可用Arf 6的大约10％，而体外GTPγS蛋白负载将激l活Arf 6的将近90％。
1，将0.5 ml每种细胞提取物等分到两个微量离心管中（或使用1 μg纯化的Arf 6
蛋白）。
2，向每个试管中加入20 μl 0.5 M EDTA（终浓度为20 mM）。
3，将5 μl 100 XGTPγS（至100 μM，终浓度）加到一个试管中（阳性对照）。
4，在第二个试管中加入5 μl 100 X GDP（至1 mM，终浓度）（阴性对照）。
5，在搅拌下将试管在30°C孵育30分钟。
6，通过将试管放在冰上并添加32.5 μl 1 M MgCl2（至60 mM，终浓度）来停止加载。
测定步骤
I.主动Arf 6下拉分析
1.将0.5 – 1 mL细胞裂解液等分到微量离心管中。
2.使用1X分析/裂解缓冲液将每个样品的体积调整为1 mL。
3.在管中加入1 μl抗活性Arf 6单克l隆抗l体。
4.通过涡旋或滴定重悬蛋白A / G琼脂糖珠浆。
5.向每个管中添加20 μL重悬浮的珠浆。
6.轻轻搅拌将试管在4°C下孵育1小时。
7.通过以5,000 x g离心1分钟来沉淀小珠。
8.吸出并丢弃上清液，确保不要干扰/除去珠粒。
9.用0.5 mL的1X Assay / Lysis Buffer洗涤磁珠3次，每次离心并吸出。
10.后一次洗涤后，将珠粒沉淀并小心除去所有上清液。
11.将磁珠沉淀重悬于20 μL 2X还原SDS-PAGE样品缓冲液中。
12.将每个样品煮沸5分钟。
13.以5,000 x g的速度离心每个样品10秒钟。
电泳和转膜
1. 取15ul样品/孔上样17%配体胶。
2. 按照制造商的说明进行SDS-PAGE。
3. 按照制造商的说明将凝胶蛋白转到PVDF或硝化纤l维素膜。
免l疫印迹反应和检测（所有步骤都是在室温下进行，并不断搅拌）
1. 将PVDF膜浸入甲l醇15s，然后在室温放置5 min晾干。
注意：如果使用的是硝化纤l维素膜，此步省略。
2. 封闭：用TBST缓冲液配制5%的脱脂牛奶或者3%BSA在室温下孵育1H进行封闭，并需要恒定振荡。
3. 孵育一抗：用TBST缓冲液配制的5%脱脂牛奶或3%BSA稀释特异性识别Cdc42活性构象的兔多克l隆抗l体（稀释比例为1:50-1:1000，主要根据样品中含有的Cdc42蛋白的量），室温下孵育1-2小时，或者4°C条件下过夜孵育。
4. 用TBST缓冲液洗涤膜三次/5min。
5. 孵育二抗：（例如羊抗兔IgG-HRP），用TBST缓冲液配制的5%脱脂牛奶或3%BSA按1:1000稀释比例稀释后使用，室温下孵育1小时并恒定振荡。
6. 用TBST缓冲液洗涤膜三次/5min。
7. 使用实验者所选择的检测方法进行显色如ECL显色法。
（作者： 来源：）
