武汉纽斯特生物科技有限公司（WuhanNewEastBiotechonologyCo.Ltd），系美国生命科学试剂供应商美国NewEastBio在的子公司。公司位于武汉东湖高新技术开发区光谷生物城.美国NewEastBio专注于生命科学和生物技术领域，主要产品有小分子、ELISA试剂盒、蛋白等，与世界高校和研究所、世界大制药公司、生物科技公司和医院等客户建立了长
Rab5B-GTP
武汉纽斯特生物科技有限公司（WuhanNewEastBiotechonologyCo.Ltd），系美国生命科学试剂供应商美国NewEastBio在的子公司。公司位于武汉东湖高新技术开发区光谷生物城.美国NewEastBio专注于生命科学和生物技术领域，主要产品有小分子、ELISA试剂盒、蛋白等，与世界高校和研究所、世界大制药公司、生物科技公司和医院等客户建立了长期稳定的合作关系，产品销往。
产品描述
ARF6（ADP-核糖基化因子6）是ARF超家族的成员。 ARF基因编码小的GTPases，它们会增加霍l乱毒l素的ADP-核糖基转移酶活性，并且对于作为磷脂酶D的激l活剂的囊泡运输至关重要。Alf6调节膜运输并起吞噬作用的调节分子的作用。
试剂制备
1X Assay/Lysis Buffer：实验前用去离子水将5X的Assay/Lysis缓冲液稀释成1X的缓冲液，并在使用前加入蛋白酶抑制l剂如1 mM PMSF, 10 μg/mL leupeptin（亮肽素），或 10 μg/mL aprotinin（抑肽酶）。
样品处理
贴壁细胞
1. 培养细胞密度达到大约80%-90%之间（直径10 cm培养皿，~107个细胞），并用活性剂或抑制l剂进行处理。
2. 吸去培养基并用冰冷的PBS洗涤两次。
3. 向细胞中加入1X Assay/Lysis缓冲液（每个直径10cm的组织培养皿中加入0.5-1mL）。
4. 将培养皿放置于冰上处理10-20分钟。
5. 用细胞刮棒把细胞从培养皿下分离下来。
6. 将细胞裂解物转入合适的管中并放置于冰上。
7. 如果核发生裂解，细胞裂解物可能会变得非常的粘稠并且难以吸取。当这种情况出现时，将细胞裂解物用27的注射l器针头来回吸取3-4次，以破坏基因组DNA，从而避免上述情况的出现。
8. 4°C 12000 g, 离心10 min。
9. 收集上清（~1-2 mg总蛋白）并放置于冰上使用。如果样品不立即使用，请将处理后的样品存放于-70°C条件下。
电泳和转膜
1. 取15ul样品/孔上样17%配体胶。
2. 按照制造商的说明进行SDS-PAGE。
3. 按照制造商的说明将凝胶蛋白转到PVDF或硝化纤l维素膜。
免l疫印迹反应和检测（所有步骤都是在室温下进行，并不断搅拌）
1. 将PVDF膜浸入甲l醇15s，然后在室温放置5 min晾干。
注意：如果使用的是硝化纤l维素膜，此步省略。
2. 封闭：用TBST缓冲液配制5%的脱脂牛奶或者3%BSA在室温下孵育1H进行封闭，并需要恒定振荡。
3. 孵育一抗：用TBST缓冲液配制的5%脱脂牛奶或3%BSA稀释特异性识别Cdc42活性构象的兔多克l隆抗l体（稀释比例为1:50-1:1000，主要根据样品中含有的Cdc42蛋白的量），室温下孵育1-2小时，或者4°C条件下过夜孵育。
4. 用TBST缓冲液洗涤膜三次/5min。
5. 孵育二抗：（例如羊抗兔IgG-HRP），用TBST缓冲液配制的5%脱脂牛奶或3%BSA按1:1000稀释比例稀释后使用，室温下孵育1小时并恒定振荡。
6. 用TBST缓冲液洗涤膜三次/5min。
7. 使用实验者所选择的检测方法进行显色如ECL显色法。
武汉纽斯特生物科技有限公司（WuhanNewEastBiotechonologyCo.Ltd），系美国生命科学试剂供应商美国NewEastBio在的子公司。美国NewEastBio专注于生命科学和生物技术领域，主要产品有小分子、ELISA试剂盒、蛋白等。
悬浮细胞
1.培养细胞并根据需要用活化剂或抑制l剂刺激。
2.进行细胞计数，然后通过离心沉淀细胞。
3.吸出培养基，并用冰冷的PBS洗涤两次。
4.完全除去PBS洗涤液，然后向细胞沉淀中加入冰冷的1X分析/裂解缓冲液
（每1 x 107池0.5 – 1 mL）。
5.通过重复移液裂解细胞。
6.将裂解物转移至适当大小的试管中，并置于冰上。
7.如果发生核裂解，则细胞裂解液可能变得非常粘稠，难以移液。如果这
发生时，裂解液可通过27号注射l器针头3-4次以剪切
基因组DNA。
8.通过离心10分钟（在4°C下为12,000 x g）清除裂解物。
9.收集上清液并将样品保存在冰上以备立即使用，或速冻并保存在-
70°C以备将来使用。
阳性和阴性对照的体外GTPγS/ GDP蛋白质上样量
注意：体内刺激细胞会激l活大约10％的可用Rab35，而
体外GTPγS蛋白负载将激l活近90％的Rab35。
1.将0.5 ml每种细胞提取物等分到两个微量离心管中（或使用1 μg纯化的Rab35蛋白）。
2.向每个试管中加入20 μl 0.5 M EDTA（至20 mM终浓度）。
3.将5 μl 100 XGTPγS（至100 μM，终浓度）加到一个试管中（阳性对照）。
4.在第二个试管中加入5 μl 100 X GDP（至1 mM，终浓度）（阴性对照）。
5.在搅拌下将试管在30°C孵育30分钟。
6.通过将试管放在冰上并添加32.5 μl 1 M MgCl2（至60
