阳性对照和阴性对照的体外GTPγS/ GDP蛋白质上样量
注意：体内细胞刺激将激l活可用Arf 6的大约10％，而体外GTPγS蛋白负载将激l活Arf 6的将近90％。
1，将0.5 ml每种细胞提取物等分到两个微量离心管中（或使用1 μg纯化的Arf 6蛋白）。
2，向每个试管中加入20 μl 0.5 M EDTA（终浓度为20 mM）
重组人Rab5B 蛋白
阳性对照和阴性对照的体外GTPγS/ GDP蛋白质上样量
注意：体内细胞刺激将激l活可用Arf 6的大约10％，而体外GTPγS蛋白负载将激l活Arf 6的将近90％。
1，将0.5 ml每种细胞提取物等分到两个微量离心管中（或使用1 μg纯化的Arf 6
蛋白）。
2，向每个试管中加入20 μl 0.5 M EDTA（终浓度为20 mM）。
3，将5 μl 100 XGTPγS（至100 μM，终浓度）加到一个试管中（阳性对照）。
4，在第二个试管中加入5 μl 100 X GDP（至1 mM，终浓度）（阴性对照）。
5，在搅拌下将试管在30°C孵育30分钟。
6，通过将试管放在冰上并添加32.5 μl 1 M MgCl2（至60 mM，终浓度）来停止加载。
免l疫印迹和检测（所有步骤均在室温下搅拌）
1.在电印迹步骤之后，将PVDF膜浸入100％甲l醇中15秒钟，然后使其在室温下干燥5分钟。
注意：如果使用硝l酸纤维素代替PVDF，则应跳过此步骤。
2.在室温下不断搅拌下，在TBST中用5％脱脂奶粉或3％BSA封闭膜1小时。
将膜与抗Arf 6兔多克l隆抗l体在5％脱脂奶粉或3％BSA / TBST中以1：501000（取决于样品中Arf 6蛋白质的量）新鲜稀释，孵育1-在室温下持续搅拌2小时或
过夜4oC。
3.用TBST将印迹的膜清洗3次，每次5分钟。
4.将膜与二抗（例如山羊抗兔IgG，HRP偶联物）一起孵育，在室温下以恒定的比例在5％脱脂奶粉或3％BSA / TBST中以1：1000的比例新鲜稀释。搅动。
5.用TBST将印迹的膜清洗3次，每次5分钟。
6.使用您选择的检测方法，例如ECL。
储存条件
试剂盒的成分在试剂盒的有效期限内必须存放于4°C条件下保存。
试剂（试剂盒内不提供，由实验者自行配置）
1. 刺激和未刺激的细胞裂解物；
2. 蛋白酶抑制l剂；
3. 4 °C 摇杆或者摇床；
4. 0.5 M EDTA (pH 8.0)；
5. 1 M MgCl2；
6. 2X reducing SDS-PAGE sample buffer；
7. 电泳和免l疫印迹相关试剂；
8. 免l疫印迹缓冲液TBST (10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.05%
Tween-20)；
9. 免l疫印迹封闭缓冲液 (TBST containing 5% 脱脂奶粉 or 3% BSA)；
10. PVDF或硝l酸纤维素膜；
11. 二抗；
12. ECL 检测试剂；
试剂制备
1X Assay/Lysis Buffer：实验前用去离子水将5X的Assay/Lysis缓冲液稀释成1X的缓冲液，并在使用前加入蛋白酶抑制l剂如1 mM PMSF, 10 μg/mL leupeptin（亮肽素），或 10 μg/mL aprotinin（抑肽酶）。
样品处理
贴壁细胞
1. 培养细胞密度达到大约80%-90%之间（直径10 cm培养皿，~107个细胞），并用活性剂或抑制l剂进行处理。
2. 吸去培养基并用冰冷的PBS洗涤两次。
3. 向细胞中加入1X Assay/Lysis缓冲液（每个直径10cm的组织培养皿中加入0.5-1mL）。
4. 将培养皿放置于冰上处理10-20分钟。
5. 用细胞刮棒把细胞从培养皿下分离下来。
6. 将细胞裂解物转入合适的管中并放置于冰上。
7. 如果核发生裂解，细胞裂解物可能会变得非常的粘稠并且难以吸取。当这种情况出现时，将细胞裂解物用27的注射l器针头来回吸取3-4次，以破坏基因组DNA，从而避免上述情况的出现。
8. 4°C 12000 g, 离心10 min。
9. 收集上清（~1-2 mg总蛋白）并放置于冰上使用。如果样品不立即使用，请将处理后的样品存放于-70°C条件下。
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