1.抗活性Arf 6，小鼠单克l隆抗l体（货号26918）：一小瓶– 22 μL（1
含50％甘油和0.05％叠氮l化钠的PBS（pH 7.4）中的浓度（mg / ml）。 该抗l体特异性识别所有脊椎动物的Arf 6-GTP。
2.蛋白A / G琼脂糖（目录号30301）：一小瓶– 400 μL 50％浆液。
3. 5X测定/裂解缓冲液（
Rab4A antibody
1.抗活性Arf 6，小鼠单克l隆抗l体（货号26918）：一小瓶– 22 μL（1
含50％甘油和0.05％叠氮l化钠的PBS（pH 7.4）中的浓度（mg / ml）。 该抗l体
特异性识别所有脊椎动物的Arf 6-GTP。
2.蛋白A / G琼脂糖（目录号30301）：一小瓶– 400 μL 50％浆液。
3. 5X测定/裂解缓冲液（目录号30302）：一瓶– 30 mL的250 mM Tris-HCl，pH 8，750mM NaCl，50 mM MgCl2，5 mM EDTA，5％Triton X-100。
4.抗Arf 6，兔多克l隆抗l体（货号21032）：一小瓶– 100 μL（1 mg / ml）
pH 7.4的PBS中含有50％的甘油。
5. 100 XGTPγS（目录号30303）：1瓶– 100 μl，10 mM，使用5 μLGTPγS标记0.5 mL细胞裂解液。
6. 100 X GDP（产品目录号30304）：一个样品瓶– 100 μl，100 mM，使用5 μL GDP标记0.5 mL细胞裂解物。
试剂准备
1X测定/裂解缓冲液：短暂混合5X储备液，并在去离子水中稀释至1X。 在使用前，添加蛋白酶抑制l剂，例如1 mM PMSF，10 μg / mL亮肽素和10 μg / mL抑肽酶。
1.将细胞（一块10厘米长的平板，约107个细胞）培养至约80-90％汇合。根据需要用活化剂或抑制l剂刺激细胞。
2.吸出培养基，并用冰冷的PBS洗涤两次。
3.完全除去PBS洗涤液，然后向细胞中加入冰冷的1X分析/裂解缓冲液（每10 cm组织培养板0.5-1 mL）。
4.将培养板放在冰上10-20分钟。
5.用刮板将其从平板上取下。
6.将裂解物转移至适当大小的试管中，并置于冰上。
7.如果发生核裂解，则细胞裂解液可能变得非常粘稠，难以移液。如果发生这种情况，可将裂解液通过27号注l射器针头3-4次以剪切基因组DNA。
8.通过离心10分钟（在4°C下为12,000 x g）清除裂解物。
9.收集上清液并将样品（约1-2 mg的总蛋白）存储在冰上以立即使用，或速冻并存储在-70°C以便将来使用。
纽斯特生物技术有限公司推出的Cdc42活性检测试剂盒主要是依据单克l隆抗l体能够特异性的识别Cdc42-GTP结合蛋白，而不识别Cdc42-GDP结合蛋白，进而简单并且的进行Cdc42的活性检测。同时试剂盒中的Cdc42-GTP单克l隆抗l体也可以进行免l疫组化实验中细胞和组织中Cdc42的活性监测。每套试剂盒可以进行20次检测。
电泳和转膜
1. 取15ul样品/孔上样17%配体胶。
2. 按照制造商的说明进行SDS-PAGE。
3. 按照制造商的说明将凝胶蛋白转到PVDF或硝化纤l维素膜。
免l疫印迹反应和检测（所有步骤都是在室温下进行，并不断搅拌）
1. 将PVDF膜浸入甲l醇15s，然后在室温放置5 min晾干。
注意：如果使用的是硝化纤l维素膜，此步省略。
2. 封闭：用TBST缓冲液配制5%的脱脂牛奶或者3%BSA在室温下孵育1H进行封闭，并需要恒定振荡。
3. 孵育一抗：用TBST缓冲液配制的5%脱脂牛奶或3%BSA稀释特异性识别Cdc42活性构象的兔多克l隆抗l体（稀释比例为1:50-1:1000，主要根据样品中含有的Cdc42蛋白的量），室温下孵育1-2小时，或者4°C条件下过夜孵育。
4. 用TBST缓冲液洗涤膜三次/5min。
5. 孵育二抗：（例如羊抗兔IgG-HRP），用TBST缓冲液配制的5%脱脂牛奶或3%BSA按1:1000稀释比例稀释后使用，室温下孵育1小时并恒定振荡。
6. 用TBST缓冲液洗涤膜三次/5min。
7. 使用实验者所选择的检测方法进行显色如ECL显色法。
（作者： 来源：）
