1.刺激的和非刺激的细胞裂解液
2.蛋白酶抑l制剂
3. 4°C管摇杆或摇床
4. 0.5 M EDTA，pH8.0
5. 1 M氯化镁
6. 2倍还原SDS-PAGE样品缓冲液
7.电泳和免l疫印迹系统
8.免l疫印迹洗涤缓冲液，例如TBST（10 mM Tris-HCl，pH 7.4，0.15 M NaCl，0
Ras antibody
1.刺激的和非刺激的细胞裂解液
2.蛋白酶抑l制剂
3. 4°C管摇杆或摇床
4. 0.5 M EDTA，pH8.0
5. 1 M氯化镁
6. 2倍还原SDS-PAGE样品缓冲液
7.电泳和免l疫印迹系统
8.免l疫印迹洗涤缓冲液，例如TBST（10 mM Tris-HCl，pH 7.4，0.15 M NaCl，0.05％
吐温20）
9.免l疫印迹封闭缓冲液（TBST包含5％脱脂奶粉或3％BSA）
10. PVDF或硝l酸纤维素膜
11.二抗
12. ECL检测试剂
试剂盒成分
特异性识别Cdc42活性构象的鼠单克l隆抗l体（Anti-active Cdc42, Mouse MonoclonalAntibody (Catalog No. 26905)）：小管装--30ul (抗l体浓度是1mg/ml)，抗l体溶于PBS（pH7.4）并包含50%的甘油和0.05%的叠氮l化钠。此抗l体可以特异性识别所有脊椎动物中的Cdc42-GTP。
Protein A/G agarose (Catalog No. 30301) ：小管装—400ul包含200ul Protein A/G agarose 和200ul 20%乙醇溶液。（使用时溶液需要充分混匀，再吸取）
5X Assay/Lysis Buffer (Catalog No. 30303)：小瓶装—30mL包含250 mM Tris-HCl (pH 8.0), 750 mM NaCl, 50 mM MgCl2, 5 mM EDTA, 5% Triton X-100。
特异性识别Cdc42活性构象的兔多克l隆抗l体（Anti-Cdc42, Rabbit Polyclonal Antibody (Catalog No.21010)）：小管装--30ul (抗l体浓度是1mg/ml)，抗l体溶于PBS（pH 7.4）并包含有 50%的甘油。
100 X GTPγS (Catalog No. 30302) ：小管装—100ul (10 mM) ，实验中0.5mL细胞裂解液使用 5ul GTPγS标记。
100 X GDP (Catalog No. 30304) ：小管装—100ul (100 mM) ，实验中0.5mL细胞裂解液使用5ul GDP标记。
武汉纽斯特生物科技有限公司（WuhanNewEastBiotechonologyCo.Ltd），系美国生命科学试剂供应商美国NewEastBio在的子公司。美国NewEastBio专注于生命科学和生物技术领域，主要产品有小分子、ELISA试剂盒、蛋白等。
悬浮细胞
1.培养细胞并根据需要用活化剂或抑制l剂刺激。
2.进行细胞计数，然后通过离心沉淀细胞。
3.吸出培养基，并用冰冷的PBS洗涤两次。
4.完全除去PBS洗涤液，然后向细胞沉淀中加入冰冷的1X分析/裂解缓冲液
（每1 x 107池0.5 – 1 mL）。
5.通过重复移液裂解细胞。
6.将裂解物转移至适当大小的试管中，并置于冰上。
7.如果发生核裂解，则细胞裂解液可能变得非常粘稠，难以移液。如果这
发生时，裂解液可通过27号注射l器针头3-4次以剪切
基因组DNA。
8.通过离心10分钟（在4°C下为12,000 x g）清除裂解物。
9.收集上清液并将样品保存在冰上以备立即使用，或速冻并保存在-
70°C以备将来使用。
阳性和阴性对照的体外GTPγS/ GDP蛋白质上样量
注意：体内刺激细胞会激l活大约10％的可用Rab35，而
体外GTPγS蛋白负载将激l活近90％的Rab35。
1.将0.5 ml每种细胞提取物等分到两个微量离心管中（或使用1 μg纯化的Rab35蛋白）。
2.向每个试管中加入20 μl 0.5 M EDTA（至20 mM终浓度）。
3.将5 μl 100 XGTPγS（至100 μM，终浓度）加到一个试管中（阳性对照）。
4.在第二个试管中加入5 μl 100 X GDP（至1 mM，终浓度）（阴性对照）。
5.在搅拌下将试管在30°C孵育30分钟。
6.通过将试管放在冰上并添加32.5 μl 1 M MgCl2（至60 mM
）。
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