测定步骤
I.主动Arf 6下拉分析
1.将0.5 – 1 mL细胞裂解液等分到微量离心管中。
2.使用1X分析/裂解缓冲液将每个样品的体积调整为1 mL。
3.在管中加入1 μl抗活性Arf 6单克l隆抗l体。
4.通过涡旋或滴定重悬蛋白A / G琼脂糖珠浆。
5.向每个管中添加20 μL重悬浮的珠浆。
Ran 蛋白
测定步骤
I.主动Arf 6下拉分析
1.将0.5 – 1 mL细胞裂解液等分到微量离心管中。
2.使用1X分析/裂解缓冲液将每个样品的体积调整为1 mL。
3.在管中加入1 μl抗活性Arf 6单克l隆抗l体。
4.通过涡旋或滴定重悬蛋白A / G琼脂糖珠浆。
5.向每个管中添加20 μL重悬浮的珠浆。
6.轻轻搅拌将试管在4°C下孵育1小时。
7.通过以5,000 x g离心1分钟来沉淀小珠。
8.吸出并丢弃上清液，确保不要干扰/除去珠粒。
9.用0.5 mL的1X Assay / Lysis Buffer洗涤磁珠3次，每次离心并吸出。
10.后一次洗涤后，将珠粒沉淀并小心除去所有上清液。
11.将磁珠沉淀重悬于20 μL 2X还原SDS-PAGE样品缓冲液中。
12.将每个样品煮沸5分钟。
13.以5,000 x g的速度离心每个样品10秒钟。
武汉纽斯特生物科技有限公司（WuhanNewEastBiotechonologyCo.Ltd），系美国生命科学试剂供应商美国NewEastBio在的子公司。美国NewEastBio专注于生命科学和生物技术领域，主要产品有小分子、ELISA试剂盒、蛋白等。
悬浮细胞
1.培养细胞并根据需要用活化剂或抑制l剂刺激。
2.进行细胞计数，然后通过离心沉淀细胞。
3.吸出培养基，并用冰冷的PBS洗涤两次。
4.完全除去PBS洗涤液，然后向细胞沉淀中加入冰冷的1X分析/裂解缓冲液
（每1 x 107池0.5 – 1 mL）。
5.通过重复移液裂解细胞。
6.将裂解物转移至适当大小的试管中，并置于冰上。
7.如果发生核裂解，则细胞裂解液可能变得非常粘稠，难以移液。如果这
发生时，裂解液可通过27号注射l器针头3-4次以剪切
基因组DNA。
8.通过离心10分钟（在4°C下为12,000 x g）清除裂解物。
9.收集上清液并将样品保存在冰上以备立即使用，或速冻并保存在-
70°C以备将来使用。
阳性和阴性对照的体外GTPγS/ GDP蛋白质上样量
注意：体内刺激细胞会激l活大约10％的可用Rab35，而
体外GTPγS蛋白负载将激l活近90％的Rab35。
1.将0.5 ml每种细胞提取物等分到两个微量离心管中（或使用1 μg纯化的Rab35蛋白）。
2.向每个试管中加入20 μl 0.5 M EDTA（至20 mM终浓度）。
3.将5 μl 100 XGTPγS（至100 μM，终浓度）加到一个试管中（阳性对照）。
4.在第二个试管中加入5 μl 100 X GDP（至1 mM，终浓度）（阴性对照）。
5.在搅拌下将试管在30°C孵育30分钟。
6.通过将试管放在冰上并添加32.5 μl 1 M MgCl2（至60 mM
）。
产品描述
一系列结构多样的配体，从光子到大肽，激l活GPCRs来激发
它们的生理功能。配体结合的GPCRs，反过来，起到鸟呤核苷酸交换的作用Gβγ存在下Gα亚基上的GDP与GTP交换的催化因子，导致Gα亚单位与Gβγ二聚体分离形成两个功能单元（Gα和Gβγ）。Gα和Gβγ亚单位都向各种细胞信号通路发出信号。根据顺序与功能同源，G蛋白分为四个家族：Gs，Gi、Gq和G12。增加这些G蛋白的效应器和相互作用蛋白的数量已经被鉴定，生理上G蛋白参与的过程正在增殖。
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