阳性对照和阴性对照的体外GTPγS/ GDP蛋白质上样量
注意：体内细胞刺激将激l活可用Arf 6的大约10％，而体外GTPγS蛋白负载将激l活Arf 6的将近90％。
1，将0.5 ml每种细胞提取物等分到两个微量离心管中（或使用1 μg纯化的Arf 6蛋白）。
2，向每个试管中加入20 μl 0.5 M EDTA（终浓度为20 mM）
IP-WB活性检测试剂盒
阳性对照和阴性对照的体外GTPγS/ GDP蛋白质上样量
注意：体内细胞刺激将激l活可用Arf 6的大约10％，而体外GTPγS蛋白负载将激l活Arf 6的将近90％。
1，将0.5 ml每种细胞提取物等分到两个微量离心管中（或使用1 μg纯化的Arf 6
蛋白）。
2，向每个试管中加入20 μl 0.5 M EDTA（终浓度为20 mM）。
3，将5 μl 100 XGTPγS（至100 μM，终浓度）加到一个试管中（阳性对照）。
4，在第二个试管中加入5 μl 100 X GDP（至1 mM，终浓度）（阴性对照）。
5，在搅拌下将试管在30°C孵育30分钟。
6，通过将试管放在冰上并添加32.5 μl 1 M MgCl2（至60 mM，终浓度）来停止加载。
免l疫印迹和检测（所有步骤均在室温下搅拌）
1.在电印迹步骤之后，将PVDF膜浸入100％甲l醇中15秒钟，然后使其在室温下干燥5分钟。
注意：如果使用硝l酸纤维素代替PVDF，则应跳过此步骤。
2.在室温下不断搅拌下，在TBST中用5％脱脂奶粉或3％BSA封闭膜1小时。
将膜与抗Arf 6兔多克l隆抗l体在5％脱脂奶粉或3％BSA / TBST中以1：501000（取决于样品中Arf 6蛋白质的量）新鲜稀释，孵育1-在室温下持续搅拌2小时或
过夜4oC。
3.用TBST将印迹的膜清洗3次，每次5分钟。
4.将膜与二抗（例如山羊抗兔IgG，HRP偶联物）一起孵育，在室温下以恒定的比例在5％脱脂奶粉或3％BSA / TBST中以1：1000的比例新鲜稀释。搅动。
5.用TBST将印迹的膜清洗3次，每次5分钟。
6.使用您选择的检测方法，例如ECL。
Arl3（类似Arf的3）是一种ADP-核糖基化因子（Arf）家族蛋白，在N端延伸方面不同于大多数Arf家族成员。 Arl3的核苷酸交换是的，并且与脂质和去污剂无关。 与GDT / GTP结合后，Arl3与一系列效应蛋白相互作用，并调节这些效应蛋白的活性，例如人类视网l膜基因4（HRG4），cGMP磷酸二酯酶的δ亚基（PDEδ）和Arl2的结合物（BART）。 Arl3还以可调节的方式结合微管，以通过与色素性视网l膜炎2（RP2）相互作用来改变胞质分裂的特定方面。 有人提出，RP2与Arl3协同作用，将光感受器中的细胞膜和细胞骨架连接为细胞的一部分
9.收集上清液并在冰上存储样品（约1-2 mg总蛋白）以进行中间使用，或将其冷冻并保存在-70°C下以备将来使用。
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