做亲和柱时,使用Sepharose 4B 和 Sepharose CL-4B有何不同?
Sepharose 4B指4%的琼脂糖
Sepharose CL-4B指4%高度铰链的琼脂糖
他们的区别在于铰链程度不一样,在亲和层析色谱中,介质铰链程度越高,化学稳定性就应该越高。这样就可以耐受更加苛刻条件洗脱而偶联的配基不会脱落。越是硬质的介质,耐受的流速也会越高。这样
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做亲和柱时,使用Sepharose 4B 和 Sepharose CL-4B有何不同?
Sepharose 4B指4%的琼脂糖
Sepharose CL-4B指4%高度铰链的琼脂糖
他们的区别在于铰链程度不一样,在亲和层析色谱中,介质铰链程度越高,化学稳定性就应该越高。这样就可以耐受更加苛刻条件洗脱而偶联的配基不会脱落。越是硬质的介质,耐受的流速也会越高。这样更节省平衡洗脱的时间。
亲和柱的适用范围
亲和柱,适用于基质复杂、要求低的样品中真菌检测的净化。亲和柱中含有抗体,能够结合萃取液中目标真菌。在净化过程中干扰物质从柱上淋洗下来,而目标真菌能够固定在柱上,之后通过适当溶剂将目标真菌从亲和柱上洗脱下来,实现了与杂质的分离。
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亲和柱的应用
亲和层析(Immunoaffinity Chromatography,IAC)提供了一个有效的方法,从液体材料中进行选择净化、化合物浓缩、分类,然后从相支持物中提取纯化样本。20世纪60年代末琼脂糖载体开始(Axen等,1967),IAC成为化学中有效分离手段之一。
Van等(1987)应用IAC技术净化了猪肉中的氯随后1989年又在此技术基础上测定了蛋、牛奶(Van,1989)中的氯。其现在已成为医类、兽药、食品检测中,前处理方法应用的重要手段。
亲和柱——亲和层析的原理
通常,在开始亲和层析前需要预行全细胞提取物的粗制,例如细胞裂解液,生长培养基。
首先将固定相装入带有流动相的色谱柱中,其中含有某类特定的生物大分子(从DNA到蛋白质,取决于实验需求)。等待一段时间使两相充分混合,随后将洗涤缓冲液倒入色谱柱中。洗涤缓冲液通过破坏非目标生物分子与固定相的较弱结合来去除非目标生物分子。目标生物分子对固定相具有较高的亲和力,因此能够保持与固定相的结合,而不会被洗涤缓冲液冲走。然后将洗脱缓冲液倒入含有剩余目标生物分子的色谱柱中。洗脱缓冲液比洗涤缓冲液,能够从更大程度上减弱靶生物分子与固定相之间的相互作用,从而洗脱靶生物分子。洗脱得到的溶液包含洗脱缓冲液和目标分子,称为洗脱液。
固定相一般是凝胶基质,常见的有琼脂糖。为了防止目标分子与配体结合过程中的空间干扰或重叠,首先将含有烃链的抑制连接到琼脂糖珠(固体支持物)上。这种具有烃链的抑制通常被称为琼脂糖珠和靶分子之间的间隔基。
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