分子与质粒载体构建
实验原理
外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下,有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠DNA连接酶。此外，Illumina还捕获了未翻译的区域，这是Nimb
pcr检测
分子与质粒载体构建
实验原理
外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下,有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠DNA连接酶。此外，Illumina还捕获了未翻译的区域，这是NimbleGen和安捷伦平台无法靶定的。两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能，而且T4噬菌体DNA连接酶还有—种大肠连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接效率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。
T4噬菌体DNA连接酶催化DNA连接反应分为3步：，T4DNA连接酶与辅助因子ATP形成酶—AMP复合物；然后，酶—AMP复合物再结合到具有5’磷酸基和3’羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化；后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。
DNA重组的方法主要有粘端连接法和平端连接法，为了防止载体本身的自连，可以通过(牛碱性磷酸酶)CIP处理克服。
连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性.但是在这个温度下，粘性末端的氢键结合是不稳定的。因此人们找到了一个折中温度，即12-16℃，连接12-16h(过夜)，这样既可大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。
单细胞测序（英语：Single cell sequencing）采取优化的下一代DNA测序技术（NGS）检测单细胞的序列，可以获得特定微环境下的细胞序列差异以方便研究其功能差异等。对个体细胞的DNA测序可以帮助我们了解例如在中的小范围细胞的变异；对其进行RNA测序可以帮助我们了解和鉴别不同的细胞类型与其表现的基因，对研究发育生物学等有较大裨益。(一)水溶液提取法稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质常用的溶剂,通常用量是原材料体积的1-5倍,提取时需要均匀的搅拌,以利于蛋白质的溶解。
分离单细胞
在全基因组扩增和测序前，有很多方法可以分离细胞个体，其中流式细胞术（FACS）较为常用。个体细胞可以用显微操作来收集，这样较为快捷而且成本较低，但是比较有技术难度，而且显微镜下对细胞的错误分类容易影响实验结果。激光捕获显微切割技术（LCM）亦可以用来收集单细胞。但是尽管激光捕获显微切割可以保留样本细胞在组织中的空间位置，但是捕获单细胞的时候容易连带周围细胞的物质。高通量的细胞个体分离还可以使用微流控技术。蛋白质定量组学服务细胞内蛋白质组丰度的动态变化对不同生命过程有重要影响。微流控技术和流式细胞技术都能准确而自动地分离无偏样本。但是，两种方法都要求首先将细胞从其为环境中脱离，因此可能在RNA表达分析中造成对转录数据的干扰。
注意事项
1. 为了避免蛋白质变性，不要对样品剧烈搅动和反复冻融。
2. 缓冲溶液成分尽量模拟细胞内环。。
3. 为了避免蛋白质的氧化，将 0.1～1 mmol/LDTT（二硫苏糖醇）(或 β-巯）加入到缓冲溶液中。
4. 为了避免重金属对目标蛋白的破坏，将 1～10 mmol/LEDTA 金属螯合剂加入。
5. 为了避免微生物生长，使用灭菌溶液。在纯化任何一种蛋白质的时候，均必须时刻对它的稳定性注意维护，使它的活性得到保护，需要牢记如下一些通用的注意事项。
6. 尽可能置于冰上或者在冷库内进行操作。
7. 蛋白浓度不要太稀。
8. 除非是进行聚焦层。否则 pH 需要合适，防止所使用的缓冲溶液 pH 与 pI 相同，使蛋白质的沉淀得以避免。
9. 使用蛋白酶，避免蛋白酶对目标蛋白的降解；在纯化细胞中的蛋白质时，将 DNA 酶加入来使得 DNA 降解，避免 DNA 对蛋白的污染。
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