污染的监测
一个好的实验室，要时刻注意污染的监测，考虑有无污染是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染。
1、阳性对照：在建立PCR反应实验室及一般的检验单位都应设有PCR阳性对照，它是PCR反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志。阳性对照要选择扩增度中等、重复性好，经各种鉴定是该产物的标本，如以重组质粒为阳性对照，其含量
粗提物定量PCR试剂
污染的监测
一个好的实验室，要时刻注意污染的监测，考虑有无污染是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染。
1、阳性对照：在建立PCR反应实验室及一般的检验单位都应设有PCR阳性对照，它是PCR反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志。阳性对照要选择扩增度中等、重复性好，经各种鉴定是该产物的标本，如以重组质粒为阳性对照，其含量宜低不宜高（100个拷贝以下）。但阳性对照尤其是重组质粒及高浓度阳性标本，其对检测或扩增样品污染的可能性很大。因而当某一PCR试剂经自己使用稳定，检验人员心中有数时，在以后的实验中可免设阳性对照。
2、阴性对照：每次PCR实验务必做阴性对照。它包括：
（1）标本对照：被检的标本是血1清就用鉴定后的正常血1清作对照；被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞作对照。
（2）试剂对照：在PCR试剂中不加模板DNA或RNA,进行PCR扩增，以监测试剂是否污染。
3、重复性试验。
4、选择不同区域的引物进行PCR扩增。
差示PCR (differential PCR, d -PCR)技术
d-PCR可以定量检测标本靶基因的拷贝数。它是将目的基因和一个单拷贝的参照基因置于一个
试管中进行PCR扩增。电泳分离后呈两条区带,比较两条区带的丰度，或在引物5°-端标记上放1射性核素后.通过检测两条区带放1射性强度即可测出目的基因的拷贝数。
定量PCR(quantitative PCR, qPCR)技术
qPCR技术是用合成的RNA作为内标来检测PCR扩增目的mRNA的量,涉及目的mRNA和内标用
相同的引物共同扩增.但扩增出不同大小片段的产物.可容易地电泳分离。一种内标可用于定量多种不同目的mRNA。qPCR可用 于研究基因表达。能提供特定DNA基因表达水平的变化.在癌1症、代谢紊乱及自身免1疫性疾病的诊断和分析中很有价值。
PCR反应五要素
参加PCR反应的物质主要有五种即引物(PCR引物为DNA部分片段,细胞内DNA复1制
的引物为一段RNA链)、酶、dNTP、模板和缓冲液(其中需要Mg2+)。
[PCR步骤]标准的PCR过程分为三步:
1.DNA变性(90°C-96*C): 双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA
2.退火(25C-65'C): 系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。
3.延伸(70°C-75*C): 在Taq酶(在72C左右，活性zui佳)的作用下，以dNTP
为原料，从引物的5'端→3'端延伸，合成与模板互补的DNA链。
每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。现在有些PCR因为扩
增区很短，即使Taq酶活性不是zui佳也能在很短的时间内copy完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在60°C -65C间进行，以减少一次升降温过程，提
高了反应速度。
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