基因表达产物通常是蛋白质,但是非蛋白质编码基因如转移RNA(tRNA)或小核RNA(snRNA)基因的表达产物是功能性RNA。
所有已知的生命,无论是真核生物(包括多细胞生物)、原核生物(细菌和古细菌)或病毒,都利用基因表达来合成生命的大分子。基因表达可以通过对其中的几个步骤,包括转录,RNA剪接,翻译和翻译后修饰,进行调控来实现对基因表达的调控。基因调控赋予细胞对结
植物转基因载体
基因表达产物通常是蛋白质,但是非蛋白质编码基因如转移RNA(tRNA)或小核RNA(snRNA)基因的表达产物是功能性RNA。
所有已知的生命,无论是真核生物(包括多细胞生物)、原核生物(细菌和古细菌)或病毒,都利用基因表达来合成生命的大分子。基因表达可以通过对其中的几个步骤,包括转录,RNA剪接,翻译和翻译后修饰,进行调控来实现对基因表达的调控。基因调控赋予细胞对结构和功能的控制,基因调控是细胞分化、形态发生以及任何生物的多功能性和适应性的基础。基因调控也可以作为进化改变的底物,因为控制基因表达的时间、位置和量可以对基因在细胞或多细胞生物中的功能(作用)产生深远的影响。在遗传学中,基因表达是基因型产生表型的基本水平。存储在DNA中的遗传密码通过基因表达得到“翻译”,并且基因表达的特性产生生物体的表型。因此,基因表达的调节对于生物体的发育至关重要。
农bacillus转化法
农bacillus包括引起植物冠瘿瘤的根癌农bacillus和引起发根病的发根农杆1菌。根癌农杆1菌和发根农bacillus有相似的遗传背景。在农bacillus介导的转化中,80%左右是由根癌农bacillus介导的,大约20%是由发根农bacillus介导的。这里主要介绍根癌农杆1菌介导的转化。
根癌农bacillusTi质粒上有一段转移DNA(T-DNA)和Vir区,在农bacillus侵染植物时,这段T-DNA可以插入到植物基因组中,使其携带的基因在植物中得以表达。Vir区共24个基因,它们表达的蛋白与T-DNA的加工和转移有关。
典型的腺病毒载体系统如:穿梭质粒pCA13/腺病毒基因组质粒pBHG11/包装细胞293细胞。pCA13/的HCMV IE启动子-多克1隆位点-SV40 AN(poly A)构成外源基因的表达盒,该表达盒的插入使腺病毒E1基因缺失,但是保留其两端侧翼序列(左侧的1~3bp的ITR,右侧从3.5kb到末端的维持病毒装配和活力必须的蛋白IX的基因),也保留了腺病毒的包装信号
φ(194~358bp);pBHG11则保留了腺病毒基因组的绝大部分,但是缺失了包装信号φ、0.5~3.7图距(mu)部分的E1区、77.5~86.2mu的E3区,293细胞是整合有Ad5 E1基因的人胚shen细胞系。pBHG11因为缺失包装信号及E1区而不能copy,pCA13带有包装信号及E1的侧翼序列,但是缺失E1区及腺病毒绝大部分基因组,同样不能copy。外源目的基因插入pCA13后,与pBHG11共转染,进入293细胞。pCA13与pBHG11在细胞内发生同源重组,同时,293细胞提供E1蛋白,从而包装产生腺病毒颗粒。该病毒的蛋白质外壳同野1生型腺病毒相似,具有同样的感1染力进入靶1细胞的能力,但是基因组DNA的E1区被外源目的基因取代,即进入靶1细胞后病毒不能copy,但可以表达目的蛋白。
基因导入细胞常用方法
不同的载体在不同的宿主细胞中繁殖,导入细胞的方法也不相同。
由于外源DNA的进入而使细胞遗传性改变称为转化,早在1943年,Avery等就发现有毒肺1炎双球菌的DNA与无毒肺1炎双球菌共培养后产生有毒性的肺1炎双球菌后代的转化现象。但DNA进入细胞的效率很低,在分子生物学和基因工程工作中可采取一些方法处理细胞,经处理后的细胞就容易接受外界DNA,称为感受态细胞,再与外源DNA接触,就能提高转化效率。例如大肠杆1菌经冰冷CaCl2的处理,就成为感受态细菌,当加入重组质粒并突然由4℃转入42℃作短时间处理,质粒DNA就能进入细菌;用高电压脉冲短暂作用于细菌也能显著提高转化效率,这称为电穿孔(electroporation)转化法
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