试剂制备
1X Assay/Lysis Buffer：实验前用去离子水将5X的Assay/Lysis缓冲液稀释成1X的缓冲液，并在使用前加入蛋白酶抑制l剂如1 mM PMSF, 10 μg/mL leupeptin（亮肽素），或 10 μg/mL aprotinin（抑肽酶）。
样品处理
贴壁细胞
1. 培养细胞密度达到大约8
IP-WB活性检测试剂盒
试剂制备
1X Assay/Lysis Buffer：实验前用去离子水将5X的Assay/Lysis缓冲液稀释成1X的缓冲液，并在使用前加入蛋白酶抑制l剂如1 mM PMSF, 10 μg/mL leupeptin（亮肽素），或 10 μg/mL aprotinin（抑肽酶）。
样品处理
贴壁细胞
1. 培养细胞密度达到大约80%-90%之间（直径10 cm培养皿，~107个细胞），并用活性剂或抑制l剂进行处理。
2. 吸去培养基并用冰冷的PBS洗涤两次。
3. 向细胞中加入1X Assay/Lysis缓冲液（每个直径10cm的组织培养皿中加入0.5-1mL）。
4. 将培养皿放置于冰上处理10-20分钟。
5. 用细胞刮棒把细胞从培养皿下分离下来。
6. 将细胞裂解物转入合适的管中并放置于冰上。
7. 如果核发生裂解，细胞裂解物可能会变得非常的粘稠并且难以吸取。当这种情况出现时，将细胞裂解物用27的注射l器针头来回吸取3-4次，以破坏基因组DNA，从而避免上述情况的出现。
8. 4°C 12000 g, 离心10 min。
9. 收集上清（~1-2 mg总蛋白）并放置于冰上使用。如果样品不立即使用，请将处理后的样品存放于-70°C条件下。
检测步骤
Ι。活性Cdc42 Pull-Down实验
1. 等分0.5-1 mL的细胞裂解物至微量离心管中。
2. 向管中加入1mL的1X Assay/Lysis 缓冲液。
3. 向管中加入1ul的活性Cdc42单克l隆抗l体。
4. 用涡旋振荡仪将protein A/G凝胶柱充分混匀，然后的吸出20ul悬浮珠浆液加入离心管中。
5. 将管置于4°C条件下孵育1H，并轻轻的进行摇动。
6. 5000g，离心1分钟。
7. 弃上清，这一步要非常小心以避免珠子的损失。
8. 用0.5 mL的1X Assay/Lysis缓冲液洗涤珠子三次，离心并弃去上清。
9. 后一次洗涤后，小心的移去所有的上清。
10. 用20ul的2X SDS-PAGE样品缓冲液重悬样品。
11. 样品煮沸5min。
12. 5000g，离心10s。
电泳和转膜
1. 取15ul样品/孔上样17%配体胶。
2. 按照制造商的说明进行SDS-PAGE。
3. 按照制造商的说明将凝胶蛋白转到PVDF或硝化纤l维素膜。
免l疫印迹反应和检测（所有步骤都是在室温下进行，并不断搅拌）
1. 将PVDF膜浸入甲l醇15s，然后在室温放置5 min晾干。
注意：如果使用的是硝化纤l维素膜，此步省略。
2. 封闭：用TBST缓冲液配制5%的脱脂牛奶或者3%BSA在室温下孵育1H进行封闭，并需要恒定振荡。
3. 孵育一抗：用TBST缓冲液配制的5%脱脂牛奶或3%BSA稀释特异性识别Cdc42活性构象的兔多克l隆抗l体（稀释比例为1:50-1:1000，主要根据样品中含有的Cdc42蛋白的量），室温下孵育1-2小时，或者4°C条件下过夜孵育。
4. 用TBST缓冲液洗涤膜三次/5min。
5. 孵育二抗：（例如羊抗兔IgG-HRP），用TBST缓冲液配制的5%脱脂牛奶或3%BSA按1:1000稀释比例稀释后使用，室温下孵育1小时并恒定振荡。
6. 用TBST缓冲液洗涤膜三次/5min。
7. 使用实验者所选择的检测方法进行显色如ECL显色法。
分析原理
基于构型特异性抗Gα13-GTP的NewEast生物科学Gα13活化检测试剂盒
从细胞提取物或体外检测活性Gα13-GTP水平的单克l隆抗l体GTPγS负载Gα13活化试验。简单地说，抗活性Gα13小鼠单克l隆抗l体用含有Gα13-GTP的细胞裂解液培养。结合的活性Gα13将被蛋白质A/G琼脂糖。用兔抗α13多克l隆抗l体免l疫印迹法检测沉淀的活性Gα13。
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