miRNA测序
microRNA(miRNA)是一种大小约21—23个碱基的单链小分子RNA,是由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成,不同于siRNA(双链)但是和siRNA密切相关。microRNA通过和靶基因mRNA碱基配对引导沉默复合体(RISC)降解mRNA或抑制mRNA的翻译,从而在转录后水平调控蛋白表达(新发现miR
dna检测
miRNA测序
microRNA(miRNA)是一种大小约21—23个碱基的单链小分子RNA,是由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成,不同于siRNA(双链)但是和siRNA密切相关。microRNA通过和靶基因mRNA碱基配对引导沉默复合体(RISC)降解mRNA或抑制mRNA的翻译,从而在转录后水平调控蛋白表达(新发现miRNA也能在转录水平调控基因表达)。miRNA在物种进化中相当保守,在动物、植物和真菌等中发现的miRNA表达均有严格的组织特异性和时序性。(2)加入25μ1/乙醇混合液,充分振荡,置冰上10min以沉淀DNA。miRNA在细胞生长和发育过程中起多种作用,包括调控发育、分化、凋亡和增殖等。
目前研究miRNA的方法主要是realtime-PCR、生物芯片技术以及第二代测序技术。基于第二代测序技术的miRNA测序,可以一次获得数百万条miRNA序列,能够鉴定出不同组织、不同发育阶段、不同疾病状态下已知和未知的miRNA及其表达差异,为研究miRNA对细胞进程的作用及其生物学影响提供了有力工具。于台式离心机以12000rpm离心5min,取上清液入另一离心管中。
lncRNA测序
长链非编码RNAs(long non-coding RNAs,lncRNAs)一般是指长度大于200 nt的RNA,位于细胞核内或胞浆中,不参与蛋白质编码功能,以RNA形式在多种层面上(表观遗传调控、转录调控以及转录后调控等)调控基因的表达水平,在生命活动中具有重要作用。逆转录病毒载体主要优点:转染范围广,可以各种细胞类型,转入的外源基因可完全融合,对细胞率高,细胞不产生病变,可建立细胞系长期持续表达外源基因。
长链非编码RNA测序(long non-coding RNA sequencing,lncRNA-Seq)是一种使用特定方法降低样本中rRNA 的丰度,对富集到的 RNA进行文库构建,再对高通量测序仪产出的数据进行信息分析的研究方法。lncRNA-Seq可一次性获得样本中全部的lncRNAs信息,对lncRNAs的类别、功能进行的深入分析,从而准确地获得与特定生物学过程(例如发育、疾病等)相关 lncRNA信息。miRNA在物种进化中相当保守,在动物、植物和真菌等中发现的miRNA表达均有严格的组织特异性和时序性。
◆ HPLC
如果合成的寡核苷酸应用于,定向诱变或定量的基因探测,那么对其纯度要求较高。脱盐或OPC纯化的寡核苷酸可能达不到要求,则HPLC纯化被广泛地用于这个目的。作为一种纯化树脂,阴离子交换树脂或反向树脂被用于寡核苷酸纯化。阴离子交换树脂的HPLC通常显示95-98%纯化效率,对于达到35-mer寡核苷酸的纯化是充分的。去除rRNA的链特异性文库,含有的RNA信息含量十分丰富,通过测序和生物信息学分析能够得到mRNA、lncRNA、circRNA的鉴定及注释信息。反向树脂化的HPLC与阴离子交换树脂的HPLC呈现相似的纯化效率。因为HPLC的纯化效率很大程度依靠寡核苷酸的长度,用HPLC法不能有效纯化长的寡核苷酸(大于35-mer)。
◆ PAGE
对于长的寡核苷酸的纯化(50-100mer),我们推荐PAGE纯化法,它使用交连的聚酰胺凝胶(电泳)作为纯化基质。尽管PAGE显示出高的纯化效率(>98%),但它在额外的步骤方面有一些缺陷,比如在PAGE之后需要提取和脱盐,继而将导致纯化产率的下降。分子生物学检测服务随着生命科学和化学的不断发展,人们对生物体的认知已经逐渐深入到微观水平。
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