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防污染PCR欢迎来电 友名生物

PCR反应特点 灵敏度高:PCR产物的生成量是以指数方式增加的,能将皮克(pg=10-12)量级的起始待测模板扩增到微克(μg=-6)水平。能从100万个细胞中检出一个靶1细胞;在病毒的检测中,PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位);在细菌学中zui小检出率为3个细菌。 简便、:PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶,一次性地将反应液加好后,即在DN
防污染PCR








PCR反应特点

灵敏度高:PCR产物的生成量是以指数方式增加的,能将皮克(pg=10-12)量级的起始待测模板扩增到微克(μg=-6)水平。能从100万个细胞中检出一个靶1细胞;在病毒的检测中,PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位);在细菌学中zui小检出率为3个细菌。

简便、:PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶,一次性地将反应液加好后,即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应,一般在2~4 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析,不一定要用同位素,无放1射性污染、易推广。

纯度要求低:不需要分离病毒或细菌及培养细胞,DNA 粗制品及RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等DNA扩增检测。







分子克1隆

PCR被广泛应用于目标DNA部分片段的克1隆,该技术被称为 PCR 克1隆。在直接PCR克1隆中,DNA(如,gDNA、cDNA、质粒DNA)的目标区域被扩增并插入到特殊设计的兼容载体中。

除了制备插入片段,PCR也是一种在在克1隆后筛选克1隆是否携带目标插入片段的有效方法。引物经过设计,可以用于确定载体中插入片段是否存在和插入方向。







污染原因:

1、标本间交叉污染:标本污染主要有收集标本的容器被污染,或标本放置时,由于密封不严溢于容器外,或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染;标本核酸模板在提取过程中,由于吸样枪污染导致标本间污染;有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散,导致彼此间的污染。

2、PCR试剂的污染:主要是由于在PCR试剂配制过程中,由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。

3、PCR扩增产物污染:这是PCR反应中主要常见的污染问题。因为PCR产物拷贝量大(一般为1013拷贝/ml),远远高于PCR检测数个拷贝的极限,所以极微量的PCR产物污染,就可形成假阳性。还有一种容易忽视,可能造成PCR产物污染的形式是气溶胶污染。在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶,在操作时比较剧烈地摇动反应管,开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染。据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝,因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题。

4、实验室中质粒的污染:在分子生物学实验室及某些用质粒做阳性对照的检验室,这个问题也比较常见。因为质粒在单位容积内含量相当高,另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂,而且在内的质粒,由于的生长繁殖的简便性及具有很强的生命力。其污染可能性也很大。





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