试剂准备
1X测定/裂解缓冲液：短暂混合5X储备液，并在去离子水中稀释至1X。 在使用前，添加蛋白酶抑制l剂，例如1 mM PMSF，10 μg / mL亮肽素和10 μg / mL抑肽酶。
1.将细胞（一块10厘米长的平板，约107个细胞）培养至约80-90％汇合。根据需要用活化剂或抑制l剂刺激细胞。
2.吸出培养基，并
Ran kit
试剂准备
1X测定/裂解缓冲液：短暂混合5X储备液，并在去离子水中稀释至1X。 在使用前，添加蛋白酶抑制l剂，例如1 mM PMSF，10 μg / mL亮肽素和10 μg / mL抑肽酶。
1.将细胞（一块10厘米长的平板，约107个细胞）培养至约80-90％汇合。根据需要用活化剂或抑制l剂刺激细胞。
2.吸出培养基，并用冰冷的PBS洗涤两次。
3.完全除去PBS洗涤液，然后向细胞中加入冰冷的1X分析/裂解缓冲液（每10 cm组织培养板0.5-1 mL）。
4.将培养板放在冰上10-20分钟。
5.用刮板将其从平板上取下。
6.将裂解物转移至适当大小的试管中，并置于冰上。
7.如果发生核裂解，则细胞裂解液可能变得非常粘稠，难以移液。如果发生这种情况，可将裂解液通过27号注l射器针头3-4次以剪切基因组DNA。
8.通过离心10分钟（在4°C下为12,000 x g）清除裂解物。
9.收集上清液并将样品（约1-2 mg的总蛋白）存储在冰上以立即使用，或速冻并存储在-70°C以便将来使用。
免l疫印迹和检测（所有步骤均在室温下搅拌）
1.在电印迹步骤之后，将PVDF膜浸入100％甲l醇中15秒钟，然后使其在室温下干燥5分钟。
注意：如果使用硝l酸纤维素代替PVDF，则应跳过此步骤。
2.在室温下不断搅拌下，在TBST中用5％脱脂奶粉或3％BSA封闭膜1小时。
将膜与抗Arf 6兔多克l隆抗l体在5％脱脂奶粉或3％BSA / TBST中以1：501000（取决于样品中Arf 6蛋白质的量）新鲜稀释，孵育1-在室温下持续搅拌2小时或
过夜4oC。
3.用TBST将印迹的膜清洗3次，每次5分钟。
4.将膜与二抗（例如山羊抗兔IgG，HRP偶联物）一起孵育，在室温下以恒定的比例在5％脱脂奶粉或3％BSA / TBST中以1：1000的比例新鲜稀释。搅动。
5.用TBST将印迹的膜清洗3次，每次5分钟。
6.使用您选择的检测方法，例如ECL。
Arf样蛋白1（Arl1）是GTpases的Ras超家族中的调控性GTPases Arf家族的成员，并且在整个真核生物中都具有高度保守的直系同源基因。 Arl1对果蝇和秀丽隐杆线虫的早期胚胎发育至关重要。 Arl1在主要序列，细胞定位和功能（膜运输调节）上与Arf1-6较相似，甚至共享几个共同的结合伴侣。 除了其在高尔基体/反式高尔基体网络中的膜运输功能中，还有报道表明Arl1在酵母中的离子稳态中可能发挥作用。
Arf6激l活测定。 经GDP（lane1）或GTPγS（lane 2）处理后，纯化的Arf6蛋白被免l疫沉淀。 用抗活性Arf6单克l隆抗l体进行免l疫沉淀。
当前没有直接测定法来测量Arl1 GTPases的激l活。
NewEast Biosciences Arl1激l活检测试剂盒基于特定于配置的单克l隆抗l体，该抗l体特异性识别Arl1-GTP，但不能识别Arl1-GDP。 鉴于单克l隆抗l体对其抗原的高度亲和力，可以在短时间内进行激l活测定。 该测定法可提供可靠的结果，并具有一致的可重复性。
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