转录组测序
转录组即某个物种或特定细胞在某一功能状态下产生的RNA的总和,是研究细胞表型和功能的一个重要手段。与基因组不同的是,转录组的定义中包含了时间和空间的限定。同一细胞在不同的生长时期及生长环境下,其基因表达情况是不相同的。转录组测序(RNA-Seq)是指利用第二代高通量测序技术进行cDNA测序,地获取某一物种特定qi官或组织在某一状态下的转录本。相对于传统芯片
dna检测
转录组测序
转录组即某个物种或特定细胞在某一功能状态下产生的RNA的总和,是研究细胞表型和功能的一个重要手段。与基因组不同的是,转录组的定义中包含了时间和空间的限定。同一细胞在不同的生长时期及生长环境下,其基因表达情况是不相同的。转录组测序(RNA-Seq)是指利用第二代高通量测序技术进行cDNA测序,地获取某一物种特定qi官或组织在某一状态下的转录本。相对于传统芯片而言,RNA-Seq无需预先设计探针,即可对物种的细胞类型的转录组进行检测,能够提供较的数字化信号,更高的检测通量以及更广泛的检测范围,是目前深入研究转录组复杂性的良好工具。microRNA通过和靶基因mRNA碱基配对引导沉默复合体(RISC)降解mRNA或抑制mRNA的翻译,从而在转录后水平调控蛋白表达(新发现miRNA也能在转录水平调控基因表达)。
EMSA实验
EMSA:凝胶迁移或电泳迁移率检测是一种检测蛋白质和DNA序列相结合的技术,初用于研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用,可用于定性和定量分析。分为2种类型:同位素标记探针,非同位素标记探针。
通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和32P同位素标记的DNA或RNA探针一同保温,在非变性的聚bing烯凝胶电泳上,分离复合物和非结合的探针。DNA-复合物或RNA-复合物比非结合的探针移动得慢。同位素标记的探针依研究的结合蛋白的不同,可是双链或者是单链。当检测如转录调控因子一类的DNA结合蛋白,可用纯化蛋白,部分纯化蛋白,或核细胞抽提液。在检测RNA结合蛋白时,依据目的RNA结合蛋白的位置,可用纯化或部分纯化的蛋白,也可用核或胞质细胞抽提液。竞争实验中采用含蛋白结合序列的DNA或RN片duan和gua核苷酸片段(特异),和其它非相关的片段(非特异),来确定DNA或RNA结合蛋白的特异性。在竞争的特异和非特异片段的存在下,依据复合物的特点和强度来确定特异结合。化学键合固定相,根据键合的基团不同可用于反相或正相色谱,其中常用的是十八烷基硅l烷(又称ODS)键合硅胶,可用于反相色谱或离子对色谱离子交换填料,用于离子交换色谱,是有一定孔径的大孔填料,用于排阻色谱。
RNA提取预备工作
RNA酶(Rnase)是导致RNA降解主要的物质。此酶非常稳定,在一些的条件下只可暂时失活,但限制因素去除后又迅速恢复活性。常规高温高压灭菌方法和蛋白抑制ji不能使所有的Rnase完全失活。
1.它广泛存在于人的皮肤上,因此制备RNA时必须戴手套
2.RNase的又一污染源是取液器。根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。一般情况下采用以DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部,可基本达到要求。
3. 塑料制品、玻璃和金属物品的处理
(1)塑料制品:尽量使用一次性无菌塑料制品。已标明RNase-free的塑料制品,如没有开封使用过,通常不必再处理。
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