第yi代腺病毒载体:一般将E1或E3基因缺失的腺病毒载体称为第yi代腺病毒载体,此类型载体在未经过纯化时可引发机体产生较强的炎1症反应和免1疫反应,纯化后可以安全使用,体内表达周期可达4周。
第二代腺病毒载体:E2A或E4基因缺失的腺病毒载体被称为第二代腺病毒载体,产生的免1疫反应较弱其载体容量和安全性方面有所改进,但病毒包装难度和出毒和病毒滴度下降厉害,应用相当局限
腺病毒滴度测定
第yi代腺病毒载体:一般将E1或E3基因缺失的腺病毒载体称为第yi代腺病毒载体,此类型载体在未经过纯化时可引发机体产生较强的炎1症反应和免1疫反应,纯化后可以安全使用,体内表达周期可达4周。
第二代腺病毒载体:E2A或E4基因缺失的腺病毒载体被称为第二代腺病毒载体,产生的免1疫反应较弱其载体容量和安全性方面有所改进,但病毒包装难度和出毒和病毒滴度下降厉害,应用相当局限。
第三代腺病毒载体:第三代载体缺失了全部的(无病毒载体,gutless vector)或大部分腺病毒基因(微型腺病毒载体,mini Ad),仅可保留ITR和包装信号序列。第三代腺病毒载体zui大可插入35kb的基因,病毒蛋白表达引起的细胞免1疫反应进一步减少,载体中引入核基质附着区基因可使得外源基因保持长期表达,并增加了载体的稳定性。这一载体系统需要一个腺病毒突变体作为辅助病毒。
腺病毒表达
腺病毒系统是很受欢迎的可以在任何哺乳动物细胞中有效瞬时表达的基因递送平台。对于难转染的细胞,如原代或非分裂细胞,采用病毒递送外源基因的方式是非常有效的选择。钟鼎生物采用293A腺病毒包装细胞系(含有腺病毒包装所必需的E1基因序列,是专为生产腺病毒和进行滴度测定而建立的),用于高滴度的copy缺陷型(E1和E3缺失)腺病毒的生产,以进行外源基因的表达。腺病毒感1染几乎所有的细胞类型,除了一些抗腺病毒感1染的淋巴1瘤细胞。腺病毒是研究原代非增殖细胞基因表达的zui佳系统,它可以使转化细胞和原代细胞中得到的结果直接进行对比;不整合到染色体中,无插入致突变性。能有效进行增殖,滴度高:腺病毒系统可产生108 pfu/ml原液,浓缩后可达1010-1011 VP/ml,这一特点使它非常适用于基因cure。
腺病毒是无胞膜的线性双链DNA病毒,目前腺病毒科分为5个属,有多种型别的腺病毒已经被开发为基因转移载体,在基础科研、基因cure和载体疫1苗领域得到广泛应用。
腺病毒的基因组长约26-46kb,这使得腺病毒载体的构建与常见质粒载体(一般长度小于10kb)不同。太长的基因组使得在腺病毒载体上富集一个多克1隆位点非常困难。针对重组腺病毒的构建,开发了多种方法。
目前已有的腺病毒载体系统均存在缺陷,有些构建步骤繁琐,耗时较长,有些在重组病毒中引入了不必要的外源序列,有些不能用于重组腺病毒的反向遗传改造。近年来,新的生物特性不同的腺病毒不断被发现,因此,本领域对构建过程更加快捷简便的、人工改造更加方便灵活的腺病毒载体系统和重组病毒构建方法存在需求。
腺病毒的结构
腺病毒含13%DNA和87%的蛋白质,病毒体分子量约为175×106。病毒基因组为线状双链DNA,大约含35kb~36kb,腺病毒12、18和31型的DNA组成中,G+C mol%zui低(48%~49%),属于对动物具有高致癌性基因型。腺病毒1、2、4、5、8等型的G+C mol%较高(61%),致癌性反而低或无。这是一种用于人腺病毒分离株的分组的标准,根据其基因同源性将人腺病毒分为A~F等6组。
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