原位杂交试验
收集斑马鱼的胚胎,在Holfretor水中培养,到达所需要的发育时期时,用蛋白酶去除卵膜,用4%多聚甲醛固定,在4℃保存,二十四小时后用50%甲6醇2%多聚甲醛溶液洗,然后换成甲9醇,在-20C 保存,待用(两天和两天以上的胚胎需要用双氧6水处理,去除色素。或者使用苯锍脲稀溶液培养,可阻断色素的形成)
原位杂交;原位杂交(in situ hybri
原位杂交仪制造厂家
原位杂交试验
收集斑马鱼的胚胎,在Holfretor水中培养,到达所需要的发育时期时,用蛋白酶去除卵膜,用4%多聚甲醛固定,在4℃保存,二十四小时后用50%甲6醇2%多聚甲醛溶液洗,然后换成甲9醇,在-20C 保存,待用(两天和两天以上的胚胎需要用双氧6水处理,去除色素。或者使用苯锍脲稀溶液培养,可阻断色素的形成)
原位杂交;原位杂交(in situ hybridization)将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交,称为原位杂交!
使用DNA或者RNA探针来检测与其互补的另一条链在细菌或其他真核细胞中的位置。
以菌落原位杂交为例:
对分散在若干个琼脂平板上的少数菌落(100-200)进行克8隆筛选时,可采用本方法。将这些菌落归并到一个琼脂主平板以及已置于第二个琼脂平板表面的一张硝5酸纤维素滤膜上。经培养一段时间后,对菌落进行原位裂解。主平板应贮存于4℃直至得到筛选结果。
原位杂交技术应用于染色体、细胞和组织切片等样品中进行核酸特异性检测,与免6疫组化技术的结合应用,能将DNA、mRNA和蛋白水平上的基因活性与样品的显微拓扑信息结合起来。1969年Pardue和Gall将放9射性标记的探针直接应用于纯化核酸的杂交,此后得益于分子克6隆技术的发展,及不同探针标记系统和检测系统的应用,大大增加了原位杂交检测的应用灵活性和检测灵敏度。

在条件都得到满足的情况下,杂交的成败就取决于保温时间。时间短了,杂交反应不完成;时间长了也无益,会引起非特异结合增多。一般杂交反应要进行20h左右。1966年Britten和Kohne推荐用Cot =值来计算杂交反应时间。Cot 值实际上是杂交液中单链起始浓度(Co)和 反应时间(t)的乘积。实验表明Cot =100时,杂交反应基本完成。Cot=0,基本上没有杂交。例如在液相杂交中未标记的DNA 400μg/ml(按单股DNA每微克 紫外吸收值为0.024计算,总的吸收值为 9.6),如果反应时间为21h,那么对于未标记的DNA来说,Cot =9.6/21 =100.8,,杂交完成了。对标记DN A(浓度为0.1μg/ml)来说Cot值为0.05,这就充分排除了标记DNA的自我复性。Tm值25℃时杂交zui佳,所以首先要根据公式(4)计算杂交体Tm 值。由此式可见,通过调节盐浓度、甲酰胺浓度和杂交温度来控制所需的严格性。

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