原位杂交技术应用于染色体、细胞和组织切片等样品中进行核酸特异性检测,与免6疫组化技术的结合应用,能将DNA、mRNA和蛋白水平上的基因活性与样品的显微拓扑信息结合起来。1969年Pardue和Gall将放9射性标记的探针直接应用于纯化核酸的杂交,此后得益于分子克6隆技术的发展,及不同探针标记系统和检测系统的应用,大大增加了原位杂交检测的应用灵活性和检测灵敏度。
杂交液中的阳离
原位杂交检测
原位杂交技术应用于染色体、细胞和组织切片等样品中进行核酸特异性检测,与免6疫组化技术的结合应用,能将DNA、mRNA和蛋白水平上的基因活性与样品的显微拓扑信息结合起来。1969年Pardue和Gall将放9射性标记的探针直接应用于纯化核酸的杂交,此后得益于分子克6隆技术的发展,及不同探针标记系统和检测系统的应用,大大增加了原位杂交检测的应用灵活性和检测灵敏度。
杂交液中的阳离子浓度通过静电排斥作用影响了杂交体之间的链稳定性,较高的盐浓度将增加杂交体的稳定性。大于0.4M的Na离子浓度,对Tm值、双链复性速率的影响不大,但随着Na离子浓度的降低,将显著影响Tm值和双链复性速率。
有2机溶2剂(甲酰胺)的作用是降低DNA-DNA和DNA-RNA等双链体的解链温度。通常DNA需要在0.1~0.2M Na+ 90~100℃的条件下变性,那么应用于原位杂交,样品必须在65~75℃的条件下进行长时间变性,这将导致样品形态学的破坏。50%甲酰胺的应用能将杂交温度降至30~45℃。
硫酸葡聚糖具有很强的水合性,高浓度的硫酸葡聚糖会使得核酸分子无法获得周边亲水环境,增加了探针浓度,加快杂交反应速率。
原位杂交 (ISH) 是用于定位固定组织和细胞中特定核酸靶标的强大技术,能够获得与基因表达和遗传位点相关的时间和空间信息。 虽然ISH的基本工作流程与印迹杂交近似,即核酸探针被合成、标记、纯化和特异性靶标退火,但其不同之处在于前者可通过可视化显示组织内的结果来获得更多信息。 如今有两种基本方法来实现可视化显示原位RNA和DNA靶标,即荧光 (FISH) 和显色 (CISH) 检测。 每种检测方法本身的特点(见下表)使得FISH和CISH适用于截然不同的应用。 虽然两种方法均使用标记的、与样本杂交的靶标特异性探针,但每种方法用于可视化显示样本的仪器不同。 这里我们将强调每种方法的不同之处和各自的优势。
武汉思特进科技发展有限公司成立于2007年,是一家以实验技术研发、实验产品研发、日化产品研发、实验项目承接为一体的高新技术公司;公司实验中心有分子生物学平台、细胞平台、光镜平台、植物组培平台、原核蛋白表达平台、日化产品生产平台;可以开展各类动、植物、细菌、细胞等生物实验。
另一种多聚体促进剂是聚丙0烯0酸,用其钠盐,浓度为2%~4%。与硫酸葡聚糖相比,其优点是价格低廉,粘度低(MW=90 000)。小分子化学试剂酚和Guandine thiocyanate也能促进杂交,它们可能是通过增加水的疏水性和降低双链和单链DNA间的能量差异而发挥作用。酚作为杂交促进剂,只能在低DNA浓度的液相杂交中观察到,该方法曾被称为酚乳化复性技术,该法不能用于固相杂交,因酚可引起核酸与膜的非特异吸附作用,即使在液相杂交中的应用也是有限的。而Guandine thiocyanate可通过降低双链DNA的Tm值而起作用。此外,该分子还可以促进RNA的杂交,有裂解细胞而抑制RNase的作用。总之,硫酸葡聚糖和聚乙二醇因能用于固相杂交是目前zui常用的杂交促进剂。

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