蛋白质双向电泳实验流程
1.三氯yi酸-bing酮沉淀法提取蛋白
2.双向电泳分离待测样品
(1)一相等电聚焦前处理按照所用仪器的厂商提供操作手册进行。蛋白质上样浓度不要超过10mg/mL,否则会造成蛋白质的聚集或沉淀。
(2)等电聚焦完毕后(约需24hr），若不立即进行第二相电泳，胶条可夹在两层塑料薄膜中于-70℃保存数月。
(3)等电聚焦好的胶
荧光定量pcr
蛋白质双向电泳实验流程
1.三氯yi酸-bing酮沉淀法提取蛋白
2.双向电泳分离待测样品
(1)一相等电聚焦前处理按照所用仪器的厂商提供操作手册进行。蛋白质上样浓度不要超过10mg/mL,否则会造成蛋白质的聚集或沉淀。
(2)等电聚焦完毕后(约需24hr），若不立即进行第二相电泳，胶条可夹在两层塑料薄膜中于-70℃保存数月。
(3)等电聚焦好的胶条按厂商提供的操作手册平衡两次。平衡完毕后，于电泳仪上用12.5%SDS-PAGE凝胶进行电泳分离。仪器设置为2.5W/胶 45min，15W/胶 5-8hr，20℃。
3.银染法对凝胶进行染色
(1)固定(2)清洗(3)增敏(4)清洗(5)染色(6)清洗(7)显影(8)定影(9)水洗
3.凝胶扫描及图像分析
(1)图像扫描：凝胶染色后采用Image scanner以300dpi，16-bit模式（65536灰阶）进行扫描。
(2)图像分析：扫描完毕后，凝胶继续置于1%yi酸中于4℃保存。扫描后的图像用ImageMaster 2D Platinum software软件进行分析。免yi共沉淀（Co-IP检测）是以抗ti和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的方法。分析按照软件厂商提供的说明书进行。以zui小点面积30，平滑度2为主要参数zui大限度检测蛋白质点。以目标蛋白质3个重复具有相同趋势，目标蛋白质相邻位点的相对一致性，至少2个重复有2倍以上差异作为判定差异表达蛋白质的标准。
Southern杂交
实验原理
Southern印迹杂交（Southern blot）是1975年由英国人southern创建，是研究DNA图谱的基本技术。Southern印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。具体操作参见SN0169-92《人民共和国进出口商品检验行业标准出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠检验方法》。一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNAl片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNAl片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放l射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量。
18.引物是经过PAGE纯化的，为什么还有碱基缺失或插入？
答：理论上分析型PAGE变性电泳，可以区分引物之间一个碱基的差别。但是制备PAGE电泳，上样量都是非常大，电泳时的条带非常宽，带与带之间有重叠，分辨率已下降，电泳后割带回收目的引物时，很难说不割到差别仅几个碱基的引物。去除rRNA的链特异性文库，含有的RNA信息含量十分丰富，通过测序和生物信息学分析能够得到mRNA、lncRNA、circRNA的鉴定及注释信息。国内有一个不好的现象，PAGE纯化的引物，特别是长引物要的量都比较高，导致割的条带有时可能比较宽。建议：您如果减少OD数，引物遇到的问题可能就会少一些。
19. TaqMan 探针设计的基本原则是什么？
答：下列原则供您参考。
◆TaqMan 探针位置尽可能靠近扩增引物（扩增产物50-150bp），但不能与引物重叠。
◆长度一般为18-40mer 。
◆G-C含量控制在40-80%左右。
◆避免连续相同碱基的出现，特别是要避免GGGG或更多G出现。
◆在引物的5'端避免使用G。
◆选用比较多的碱基C。
◆退火温度Tm控制在 68-70C 左右。
有用的荧光染料参数
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