腺病毒是无包膜的线性双链DNA病毒,在自然界分布广泛,至少存在100种以上的血1清型。其基因组长约36kb,两端各有一个反向末端重复区(ITR),ITR内侧为病毒包装信号。基因组上分布着4个早期转录元(E1、E2、E3、E4)承担调节功能,以及一个晚期转录元负责结构蛋白的编码。早期基因E2产物是晚期基因表达的反式因子和copy必须因子,早期基因E1A、E1B产物还为E2等早期基
逆转录病毒包装
腺病毒是无包膜的线性双链DNA病毒,在自然界分布广泛,至少存在100种以上的血1清型。其基因组长约36kb,两端各有一个反向末端重复区(ITR),ITR内侧为病毒包装信号。基因组上分布着4个早期转录元(E1、E2、E3、E4)承担调节功能,以及一个晚期转录元负责结构蛋白的编码。早期基因E2产物是晚期基因表达的反式因子和copy必须因子,早期基因E1A、E1B产物还为E2等早期基因表达所必须。因此,E1区的缺失可造成病毒在copy阶段的流1产。E3为copy非必须区,其缺失则可以大大地扩大插入容量。腺病毒载体大多以5型(Ad5)、2型(Ad2)为基础,新增了55型(Ad55),很多研究机构在研究当中,55型将比5型流行以及应用更具广泛性。
位点特异性重组法
这类方法使用来源于噬菌体的重组酶,这类重组酶能够识别特异性序列位点(长度数十碱基对至数百碱基对)并引发含有该位点的序列之间的重组;在腺病毒骨架和穿梭质粒中添加重组酶能够识别的特异性位点,在细胞内表达对应的噬菌体重组酶或体外使用重组酶,介导骨架质粒和穿梭质粒之间的位点特异性重组,将目的基因引入骨架质粒,形成带有重组腺病毒基因组的腺病毒质粒;转染包装细胞,进行病毒载体拯救。该方法进一步简化了腺病毒质粒的制备过程,它的缺限是在腺病毒基因组的某些部位不可避免的残留了重组酶特异性识别位点。
腺病毒是如何构成的
病毒滴度滴定(组织培养半数感1染量TCID 50):将分装好的病毒液接种一长满单层Hep-2细胞的96孔板,第yi列每孔加25μl病毒液,作1/lO 稀释,此后依次作倍比稀释,每稀释度接种8孔,zui后一列做阴性对照.对照孔和感1染病毒孔均加入100μl维持液,置37℃ 、5%CO2 培养箱中培养。每天观察并记录出现CPE的孔数及具体时间,待细胞病变不再发展后,观察记录结果,用Reed-Muench法计算病毒滴度TCID 50。
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