分子实验介绍——荧光检测
细胞荧光染色是以荧光物质标记而进行抗原定位的技术。在细胞中,通过特定的标记,可以检测目的蛋白表达量和表达定位。是细胞中的可直观观察细胞内蛋白定位和表达的实验方法。
实验流程:细胞固定-细胞膜破膜-蛋白封闭-目的蛋白结合-荧光二抗结合-DAPI染色-荧光显微镜拍照或激光共聚焦显微镜拍照。
结果示例:
细胞荧光染
通
fish检测
分子实验介绍——荧光检测
细胞荧光染色是以荧光物质标记而进行抗原定位的技术。在细胞中,通过特定的标记,可以检测目的蛋白表达量和表达定位。是细胞中的可直观观察细胞内蛋白定位和表达的实验方法。
实验流程:细胞固定-细胞膜破膜-蛋白封闭-目的蛋白结合-荧光二抗结合-DAPI染色-荧光显微镜拍照或激光共聚焦显微镜拍照。
结果示例:
细胞荧光染
通过观察细胞中蛋白的荧光强度和定位分析该蛋白的表达变化。
miRNA测序
microRNA(miRNA)是一种大小约21—23个碱基的单链小分子RNA,是由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成,不同于siRNA(双链)但是和siRNA密切相关。除了文中提到了三个主流平台,外显子组捕获方面的新产品也在不断推出,研究人员的选择也将更广泛。microRNA通过和靶基因mRNA碱基配对引导沉默复合体(RISC)降解mRNA或抑制mRNA的翻译,从而在转录后水平调控蛋白表达(新发现miRNA也能在转录水平调控基因表达)。miRNA在物种进化中相当保守,在动物、植物和真菌等中发现的miRNA表达均有严格的组织特异性和时序性。miRNA在细胞生长和发育过程中起多种作用,包括调控发育、分化、凋亡和增殖等。
目前研究miRNA的方法主要是realtime-PCR、生物芯片技术以及第二代测序技术。报告:根据证实为大肠阳性的管数,查MPN表,报告每100ml(g)大肠菌群的MPN值。基于第二代测序技术的miRNA测序,可以一次获得数百万条miRNA序列,能够鉴定出不同组织、不同发育阶段、不同疾病状态下已知和未知的miRNA及其表达差异,为研究miRNA对细胞进程的作用及其生物学影响提供了有力工具。
RNA提取预备工作
RNA酶(Rnase)是导致RNA降解主要的物质。此酶非常稳定,在一些的条件下只可暂时失活,但限制因素去除后又迅速恢复活性。常规高温高压灭菌方法和蛋白抑制ji不能使所有的Rnase完全失活。
1.它广泛存在于人的皮肤上,因此制备RNA时必须戴手套
2.RNase的又一污染源是取液器。根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。一般情况下采用以DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部,可基本达到要求。
3. 塑料制品、玻璃和金属物品的处理
(1)塑料制品:尽量使用一次性无菌塑料制品。已标明RNase-free的塑料制品,如没有开封使用过,通常不必再处理。
蛋白质的分离纯化在生物化学研究应用中使用广泛,是一项重要的操作技术。 一个典型的真核细胞可以包含数以千计的不同蛋白质,一些含量十分丰富,一些仅含有几个拷贝。为了研究某一个蛋白质,必须首先将该蛋白质从其他蛋白质和非蛋白质分子中纯化出来。
一、主要方法
1. 蛋白质的选择吸附分离(利用颗粒不同程度的颗粒吸附力来使分离的目的达到)。
2. 按照配体特性的分离-亲和层析(利用蛋白质分子与另一种称为配体的分子能够特异结合这一生物性质)。
3. 低温沉淀法,使用如,乙醇等与水可混溶的,降低多数蛋白质的溶解度并且将其析出,和盐析相比较,这种方法的分辨率更加的高,然而蛋白质比较容易变形,需要在低温下进行。
4. 按照分子大小不一样的方法,密度梯度离心(在介质中对蛋白质离心时,蛋白质沉降速度取决于它的质量和密度,质量和密度越大,那么沉降越快;凝胶过滤(一种柱层析);超过滤(利用蛋白质分子不能从半透膜通过的性质)。
5. 按照溶解度差异分离,等电点沉淀法盐溶与盐析(使用一定浓度盐溶液来使蛋白质的溶解度增大或减小);(因为在等电点时蛋白质分子的净电荷为 0,使分子间静电斥力减少了,所以,聚集沉淀比较容易,这时具有小的溶解度)。
6. 按照电荷不同的分离方法。主要分为离子交换层析和电泳分离。
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