PCR方法已广泛用于科研,在工业中也有不断扩大应用的趋势,它包括检测一些病原体、检测支原体污染、检测细菌污染以及检测残留宿主DNA等。
PCR在工业中的应用主要存在一个方法验证的问题,尤其是灵敏度的验证。灵敏度不够,就会发生漏检。另外,PCR所直接面对的样本是DNA,而非病原菌或DNA,因此还需要做DNA抽提,这也是要注意的。
因此,如能采用PCR检测支
核酸提取
PCR方法已广泛用于科研,在工业中也有不断扩大应用的趋势,它包括检测一些病原体、检测支原体污染、检测细菌污染以及检测残留宿主DNA等。
PCR在工业中的应用主要存在一个方法验证的问题,尤其是灵敏度的验证。灵敏度不够,就会发生漏检。另外,PCR所直接面对的样本是DNA,而非病原菌或DNA,因此还需要做DNA抽提,这也是要注意的。
因此,如能采用PCR检测支原体并替代药典方法,还是能节省很多时间和精力。但PCR方法的验证需要较为完整。灵敏度验证是一个重要方面。灵敏度不够,就会发生漏检。《欧洲药典》第2.6.7章(EP 2.6.7)和《日本药典》第十七版第G3章(JP G3),都规定,对于核酸扩增法(如PCR)检测支原体,如替代传统的培养法,都要求检测限达到10 CFU/ml。
具体验证可使用10CFU的支原体灵敏度标准品,它一般为冻干粉形式,需要用待测样本的样本基质(需保证里面不含支原体)来复溶,再进行DNA抽提以及PCR检测。如检测的电泳有条带,或者qPCR检测后的Ct值小于40,即表明检测成功。
从动物组织中提取基因组DNA
使用研钵进行匀浆时:
① 取1~100 mg的动物组织或人组织移入冰浴预冷的研钵中,用力展研成匀浆。注)下列组织请加液氮研磨至粉末状。
A.富含DNA酶的胰脏、脾1脏、胸腺、淋巴等组织。
B.富含胶原蛋白的皮肤、肌腱等组织。
C.富含角质蛋白的组织或坚硬的组织(如骨骼)等。
② 加入650 μl的Solution A和0.9 μl的RNase A1,温和研磨30秒钟。注)使用上述①-注)的实验材料时,请在加入Solution A及RNase A1后,将研钵置于65℃水浴上研磨1分钟。
③ 收集650 μl研磨好的组织匀浆液移至Collection Tube中。如果匀浆体积不足650 μl,请补充Solution A至650 μl,65℃保温5分钟。
使用研磨棒进行匀浆时:
① 取1~100 mg的动物组织或人组织移入冰浴预冷的Collection Tube 中,用研磨棒研磨成糊状。
② 加入350 μl的Solution A和0.9 μl的RNase A1后用研磨棒研磨成匀浆。
③ 加入350 μl的Solution A将研磨棒上的匀浆冲入Collection Tube中,充分振荡混合后,65℃保温5分钟。
适用于PCR研究的提取法:
1 田间剪取植株新鲜叶片5-10mg(约2cm长)左右,新鲜叶片放于1 5ml离心管中,存于冰盒中,根据样品号贴上相应的标签。
2 用剪刀将叶片组织剪细(约0 5cm长)放在点穴式研板中。
3 加入400μlDNA提取缓冲液,用玻棒将叶组织研细,直到液体变成深绿色即可。
4 再加400μlDNA提取缓冲液,混合均匀,转入一新的1 5ml离心管(贴上相应的编号)。
5 加400μl氯1仿,混合均匀后,2400×g离心30s,将上清液转入一支新的1 5ml离心管(贴上相应的编号)。
6 加800μl无水乙醇,混匀,2400×g离心3min。弃上清。
7 70%乙醇冲洗,风干。
8 用50μlTE缓冲液溶解,存于-20℃。
9 取1μl用于PCR分析。
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