成纤维细胞分离方法
1.处死孕鼠，全身置于75%酒精里浸泡，然后在超净台中用剪刀和镊子将孕鼠皮肤剪开，用另外- -组剪刀、镊子剪开腹部肌层，露出，后用第三组剪刀和镊子将小心取出放在盛有D-PBS的玻璃平皿中，冲洗去血。
2.用两把弯镊子将胚胎外的胞膜小心去除，然后夹掉头和内脏，将其余胚胎转移到一个装有30 ml D-PBS的50 ml离心管中，轻轻颠倒两次，倒掉D-
流式细胞检测
成纤维细胞分离方法
1.处死孕鼠，全身置于75%酒精里浸泡，然后在超净台中用剪刀和镊子将孕鼠皮肤剪开，用另外- -组剪刀、镊子剪开腹部肌层，露出，后用第三组剪刀和镊子将小心取出放在盛有D-PBS的玻璃平皿中，冲洗去血。
2.用两把弯镊子将胚胎外的胞膜小心去除，然后夹掉头和内脏，将其余胚胎转移到一个装有30 ml D-PBS的50 ml离心管中，轻轻颠倒两次，倒掉D-PBS,再重复此步骤一次，注意要留少许D-PBS，然后将胚胎转移到另- -装有D-PBS的平皿中，并用手术刀片将其细细切碎。一般流程：细胞接种培养-划痕-不同时间点拍照细胞迁移和侵袭实验是体外模拟细胞迁移和侵袭能力的检测方法。
3. 用200 μ的移液反复、地吹打平皿中的液体，转移至15 ml离心管中，于4C 1500 rpm离心5分钟，倒掉上清，以10 ml胰酶重悬沉淀，放在37C水浴中消化30分钟，且每隔五分钟轻轻晃动，使之充分消化。
4.将上层细胞悬液倒入一个装有10 ml MEF生长培养基的50 ml离心管中，用200目的尼龙网过滤后，以1500 rpm离心5分钟收集细胞，再用30 ml MEF生长培养基洗涤两次。
5.细胞沉淀用15 ml MEF生长培养基重悬后进行细胞计数(- -般8只14天的胎鼠可获得2-3x107细胞)。
6. 3x106细胞悬浮于15 ml MEF生长培养基中，接种到200 ml培养瓶中。
7. 24小时后更换新鲜的MEF生长培养基。
8.细胞长满后，先用D-PBS冲洗，倒掉后加胰酶消化(此步时间不宜过长，作者- -般不超过五分钟)，按1:5传代。
9. 细胞再次长到覆盖率80-90%左右， 将其消化后，常规冻存(冻存液要现配)。
Q:中可能出现的沉淀物是什么？
A:基于多年的实验研究，用于细胞培养的胎牛以及其它中可能会存在以下种类的沉淀物：
（1）纤维蛋白，它是经常出现的较大的沉淀物，可以达到 1-2mm，可以用肉眼观察到。因为都是在低温下进行收集和处理的，一些纤维蛋白原（可溶性的形成絮状纤维蛋白的前体）在处理过程中仍然处于溶解状态，当经过的过滤分装后，就会在瓶中凝结出现纤维蛋白沉淀。破损时凋亡细胞表面的磷脂腺丝氨酸(PS)可以从细胞内膜翻转至细胞的外膜。
（2）磷酸钙，它也是常见的一种沉淀物，通常会使出现浑浊，并且在 37℃ 培养的时候会增加。这种沉淀物在倒置显微镜下观察像小黑点， 这些小黑点由于布朗运动看上去可以活动，因此经常被误认为是微生物污染。
（3）胆固醇、脂肪酸酯以及一些蛋白质。他们也是中出现沉淀物的常见原因。
什么是脂质体？脂质体转染的原理和步骤？
细胞转染的方法主要包括：电穿孔法、显微注射、基因、磷酸钙共沉淀法、脂质体转染法、多种阳离子物质介导、病毒介导的转染等，理想的细胞转染方法是具有高转染效率、对细胞的毒性作用小等。
一、脂质体 (liome) 转染方法原理
脂质体 (liome) 转染方法原理：脂质体 ((Iiome) 作为体内和体外输送载体的工具，已经研究的十分广泛，用合成的阳离子脂类包裹 DNA，同样可以通过融合而进入细胞。使用脂质体将 DNA 带入不同类型的真核细胞，与其它方法相比，有较高的效率和较好的重复性的。大鼠gu髓间充质gan细胞的分离操作方法(1)取SD大鼠(2周龄)，颈椎脱臼法处死后立即用75%乙醇浸泡，移入超净工作台内，用大头针固定大鼠四肢于工作台面的泡沫板上。
中性脂质体是利用脂质膜包裹 DNA，借助脂质膜将 DNA 导入细胞膜内。带正电的阳离子脂质体，DNA 并没有预先包埋在脂质体中，而是带负电的 DNA 自动结合到带正电的脂质体上，形成 DNA-阳离子脂质体复合物，从而吸附到带负电的细胞膜表面，经过内吞被导入细胞。结论:用贴壁法成功建立了大鼠血管内皮细胞体外培养方法,冻存细胞存活率高,为体外研究提供了稳定的模型。
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