原位杂交是指将特定标记的已知顺序核酸为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交,从而对特定核酸顺序进行精3确定量定位的过程。原位杂交可以在细胞标本或组织标本上进行。
原位杂交技术(In situ hybridization,ISH)是分子生物学、组织化学及细胞学相结合而产生的一门新兴技术,始于20世纪60年代。
原位PCR;原位杂交细胞定位和PCR的高灵敏度相结合的技术,
植物组织原位杂交
原位杂交是指将特定标记的已知顺序核酸为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交,从而对特定核酸顺序进行精3确定量定位的过程。原位杂交可以在细胞标本或组织标本上进行。
原位杂交技术(In situ hybridization,ISH)是分子生物学、组织化学及细胞学相结合而产生的一门新兴技术,始于20世纪60年代。
原位PCR;
原位杂交细胞定位和PCR的高灵敏度相结合的技术,在细胞(爬片、甩片或涂片)或组织(石蜡、冰冻切片)上直接对靶基因片段进行扩增,通过掺入标记基团直接显色或结合原位杂交进行检测的方法。
间接标记的方法中应用了报告分子标记的探针,报告分子通过亲和酶促的方法进行显色。常用的报告分子如地高6辛,生物素。结合地高6辛抗6体或链霉亲和素上耦联的酶系统进行间接的底物反应检测。地高6辛标记核酸的历史可追溯到1987年,由于地高6辛是洋地黄的花和叶中特有的成分,检测时使用的地高6辛抗6体不会结合于其他的生物分子。这是相较于生物素标记系统的优势。地高6辛抗6体上可耦联碱性磷酸酶、过氧化酶,及荧光分子和胶体金等,根据不同的应用需求,呈现高信噪比的核酸检测结果。但需注意,由于引入了免6疫检测反应,在放大检测灵敏度的同时,应注意样品内源性酶的灭活,以降低检测背景。
通过不同标记方法的联合应用,还可在同一样本中实现染色体不同区域或细胞样本中不同RNA序列的多重检测。
原位杂交中探针的选择
DNA探针、RNA探针和寡核苷酸探针均能通过不同的酶促分子反应进行标记。寡核苷酸探针的长度较短,因此避免了探针内部退火的问题,在杂交时的渗透能力也更好,探针与靶标的接触这是影响原位杂交是否成功的重要因素之一。DNA探针、RNA探针在合成时需要控制探针片段长度,通常300-1000bp左右,能覆盖到较长片段的靶核酸序列,增加检测的灵敏度。
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