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为什么需要冻存袋？

细胞培养的传代及日常维持过程中，在培养器具、培养液及各种准备工作方面都需大量的耗费，而且细胞一旦离开活物开始原代培养，它的各种生物特性都将逐渐发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化。因此及时进行细胞冻存十分必要。细胞冷冻储存在-70℃冰箱中可以保存一年之久；细胞储存在液氮中，温度达-196℃，理论上储存时间是没有限制的。

冻存袋的作用

适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种的作用。除此之外，还可以利用细胞冻存的形式来购买、寄赠、交换和运送某些细胞。 细胞冻存时向培养基中加入保护剂--终浓度5%．15%的甘油或二亚砜(DMSO)，可使溶液冰点降低，加之在缓慢冻结条件下，细胞内水分透出，减少了冰晶形成，从而避免细胞损伤。

冻存袋方法的改进

自1977年以来,我们应用四级梯度降温冻存法对30余株哺乳动物细胞及2株节肢动物细胞共1000多支安瓶进行了冷冻保存,效果较好,大部分细胞的活存率在70%以上。在此基础上对8株抗登革4型(DEN一4)病毒杂交瘤细胞400多支安靓进行了冻存。鉴于四级降温冻存法步骤多,需要经过4℃冰箱和一20℃冰箱长达7~8小时的梯度降温,较难适应单工作中细胞冻存的需要。因此,自1982年以来我们摸索了影响细胞冻存的主要因素,确定了杂交瘤细胞冻存的适保护剂浓度(1.2〕,并研制成功细胞冻存简易装置。

细胞冻存复苏方法

1. 细胞实验室进行常规消毒，紫外照射40min以上。

2. 培养液（DMEM）、0.25％胰蛋白酶（Trypsin）恒温水浴箱37°C预热20min，备用。

3. 二亚砜（DMSO)在40°C冰箱中冷藏30min，备用。

4. 从液氮保存罐中取出冻存管，立即放入400°C水浴中，摇晃，直至冻存液完全融化。

5. 将细胞悬液移入15ml离心管，缓慢加入4ml培养液，离心（1000r/min，5min）。

6. 用培养液悬液混悬沉淀细胞，调整细胞浓度，方培养箱中培养。

7. 记录复苏日期。