DNA测序检测
1. PCR测序反应
(1)取0.2ml的PCR管，用记号笔编号，将管插在颗粒冰中，按下表加试剂:
所加试剂测定模板管标准对照管
BigDye Mix
1μl
待测的质粒DNA
1μ 1
pGEM-3Zf (+)双链DNA
-1μ1
待测DNA的正向引物
M13(-21)引物- 1μ 1
灭
fish检测
DNA测序检测
1. PCR测序反应
(1)取0.2ml的PCR管，用记号笔编号，将管插在颗粒冰中，按下表加试剂:
所加试剂测定模板管标准对照管
BigDye Mix
1μl
待测的质粒DNA
1μ 1
pGEM-3Zf (+)双链DNA
-1μ1
待测DNA的正向引物
M13(-21)引物- 1μ 1
灭菌去离子水
2μ 1
总反应体积5μ 1,不加轻矿物油或石蜡油，盖紧PCR管，用手指弹管混匀，稍离心。
(2)将PCR管置于9600或2400型PCR仪.上进行扩增。98C变性2min后进行PCR循环，
PCR循环参数为96C 10s， 50C 5s， 60°C4min， 25 个循环，扩增结束后设置4C保温。
2.乙醇法纯化PCR产物
(1) 将混合物离心，将扩增产物转移到1.5ml EP管中。
(2)加入25μ 1/乙醇混合液，充分振荡，置冰上10min以沉淀DNA。12 000r/min于
4C离心30 min,小心弃上清。
(3)加70%(V/V)的乙醇50μ 1 洗涤沉淀2次。12 000r/min 于4C离心5min,小心弃上清和
管壁的液珠，真空干燥沉淀10~ 15min。
3.电泳前测序PCR产物的处理。
(1)加入12μ 1的TSR于离心管中，剧烈振荡，让其充分溶解DNA沉淀，稍离心。
(2)将溶液转移至盖体分离的0.2ml PCR管中，稍离心。
(3)在PCR仪上进行热变性(95C 2min),冰中骤冷，待_上机。
4..上机操作按仪器操作说明书安装毛细管，进行毛细管位置的校正，人工手动灌胶和建立
运行的测序顺序文件。
5.仪器将自动进行序列分析，并可根据用户要求进行序列比较。如测序序列已知，可通过
序列比较以星号标出差异碱基处，提高工作效率。
6.测序完毕按仪器操作规程进行仪器清洗与保养。
活性氧检测试剂盒（Reactive oxygen species assay kit）是一种利用荧光探针DCFH-DA进行活性氧检测的试剂盒。DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。检测DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。 本试剂盒提供了活性氧阳性对照试剂Rosup以便于活性氧的检测。该研究结果发表在《NatureBiotechnology》上。Rosup是一种混合物（compound mixture），浓度为50mg/ml。
一、注意事项
1、探针装载后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高。
2、探针装载完毕并洗净残余探针后，可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描，以确认探针的装载情况是否良好。
3、尽量缩短探针装载后到测定所用的时间（刺激时间除外），以减少各种可能的误差。
4、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
7.如何检测引物的纯度？
答：实验室方便的作法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的16%的聚酰胺凝胶进行电泳。取0.2-0.5OD的引物，用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和，上样前加热变性(95℃,2mins)。加入尿素的目的一是变性，二是增加样品比重，容易加样。600V电压进行电泳，一定时间后(约2-3小时)，剥胶，用荧光TLC板在紫外灯下检测带型，在主带之下没有杂带，说明纯度是好的。往每个EP管中加入250ul，剧烈震荡30s，冰上静置12min[问l。如果条件许可，也可以用EB 染色或银染方式染色。
而有的厂家提供Maldi-TOF质谱QC质量控制，从而保障了合成的准确率：
Bioneer使用多重Maldi-TOF质谱仪进行全自动装载及监测。 每份样品的质谱分析数据将自动插入到寡核苷酸的信息单中。Bioneer是世界上仅有的几个对生产的每份核苷酸 (单个寡核苷酸和高通量和成) 都用MALDI-TOF质谱仪检测进行核苷酸QC检测的厂商，而且免费提供质谱数据。有丝分裂过程中DNA链之间的错配引起的fu制滑动被认为是导致STR产生的较为常见原因，并且依据不同fu制单元大小的不同以及不同物种之间，fu制滑动发生的概率也不相同。
8.如何计算引物的浓度？
答：引物保存在高浓度的状况下比较稳定。引物一般配制成10-50pmol/ul。 一般情况下，建议将引物的浓度配制成50pmol/ul，加水的体积（微升）按下列方式计算：V (微升)= OD数*（乘）33 *（乘）*（乘）20000 / (除) 引物的分子量。引物的分子量可以从合成报告单上获得。(3)在PCR仪上进行热变性(95C2min),冰中骤冷，待_上机。如果需要配制成其他浓度，按上述公式换算。
注意：1 OD260= 33 ug/ml.
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