RNA提取
1.弃去培养液，用PBS清洗两次1-2。
2.弃去PBS，用1000u1吸干净残余PBS。
3.加1ml TRIZOL研磨B 41。
4. 1.5mIEP管标号与每孔相对应备用。
5.研磨好的溶液转移至对应的 EP管。
6.往每个EP管中加入250ul，剧烈震荡30s， 冰上静置12min[问l。
7. 所有样品4C离心
pcr引物设计
RNA提取
1.弃去培养液，用PBS清洗两次1-2。
2.弃去PBS，用1000u1吸干净残余PBS。
3.加1ml TRIZOL研磨B 41。
4. 1.5mIEP管标号与每孔相对应备用。
5.研磨好的溶液转移至对应的 EP管。
6.往每个EP管中加入250ul，剧烈震荡30s， 冰上静置12min[问l。
7. 所有样品4C离心，转速: 13500转1分钟，时间: 15min.
8. 再次标记一批同样编号EP管。
9.离心后吸上清液400u1移入相应编号的EP管中，再加入400ul异充
分混匀。4C冰箱35min。
10. 4C离心，转速: 13500转1分钟，时间: 10min.
11.弃去.上清液，加1m175%乙醇，轻摇7]。
12. 4C离心，10600转/分钟，时间: 5min.
13. 弃上清液滤纸吸干。
14. 加DEPC水10ul溶解，-80C保存。进行逆转录前测浓度。
组织RNA提取
1、剪米粒大小组织块放入EP管中标号。
2、EP管中加300ul trizol浸泡30分钟或更久。
3、用研磨棒研磨，以肉眼很难看到组织为宜。
4、加700u1 trizol静 置5分钟。
LncRNA芯片
Long non-coding RNAs（lncRNAs）是一类转录本长度超过200 nt的功能性非编码RNA分子。目前的研究已证实，lncRNA参与X染色体沉默，基因组印记以及染色质修饰，转录ji活，转录干扰，核内运输等多种重要调控过程。-个染色体区域可以有很多SNP位点,但是我们一-旦掌握了这个区域的单体型,就可以只使用少数几个标签SNPs(tagSNP)来进行基因分型,获取大部分的遗传多态模式。随着对lncRNA在哺乳动物进化及人类疾病发生和发展中作用的日益关注，lncRNA调控机制已成为当前遗传学研究的热点问题。
筛选出差异表达的lncRNA是研究其在人类疾病发生中所扮演角色的基础。富衡生物为用户提供高通量的lncRNA芯片进行lncRNA表达谱分析，该芯片基于Agilent的SurePrint技术生产，实验。
技术优势
信息覆盖广泛：覆盖了多个quan威lncRNA数据库发布的数据；提供人，小鼠，大鼠的lncRNA检测。
lncRNA和mRNA同时检测：芯片上包含有的lncRNA和新的mRNA序列检测探针。一次芯片实验可同时对lncRNA和mRNA进行分析。
平台成熟可靠：采用Agilent原位喷墨合成技术，了高检测灵敏度和特异性。
数据分析：提供lncRNA和mRNA表达谱差异分析和功能分析，以及二者的关联分析。
3、参数设置
使用488nm激发波长，525nm发射波长，实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱。DCF的荧光光谱和FITC非常相似，可以用FITC的参数设置检测DCF。DCF的激发光谱和发射光谱参考下图。
4、其它说明
阳性对照可以按照1：1000的比例使用。例如装载好探针的细胞共1毫升，可以加入1微升的阳性对照刺激。通常刺激后20-30分钟内可以观察到非常显著的活性氧水平升高。1QPCRbuffer5μldNTPmix(2mM)4μl引物1(10pM)μl2引物2(10pM)2μlTaq酶(2U/ul)1μlDNA模板(50ng-1μg/μl)1μl加ddH2O至μl50视PCR仪有无热盖,不加或添加石蜡油。对于不同的细胞，活性氧阳性对照的效果可能有较大的差别。如果在刺激后30分钟内观察不到活性氧的升高，可以适当提高活性氧阳性对照的浓度。如果活性氧升高得过快，可以适当降低活性氧阳性对照的浓度。
另外，对于某些细胞，如果发现没有刺激的阴性对照细胞荧光也比较强，可以按照1：2000-1：5000稀释DCFH-DA，使装载探针时DCFH-DA的浓度为2-5微摩尔/升。探针装载的时间也可以根据情况在15-60分钟内适当进行调整。
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