pcr扩增的基本原理
基本原理：PCR技术的基本原理类似于DNA的天然copy过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。DNA的半保留复1制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则copy成同样的两分子拷贝。
在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以
防污染探针法定量
pcr扩增的基本原理
基本原理：PCR技术的基本原理类似于DNA的天然copy过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。DNA的半保留复1制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则copy成同样的两分子拷贝。
在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复1制。
PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带 与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引 物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。适当提高退火温度或采用二温度点法（93℃变性，65℃左右退火与延伸）。
不对称PCR(asymmetric PCR）枝术
两种引物浓度比例相差较大的PCR技术称不对称PCR.在扩增循环中引入不同的引物浓度.常用
50~ 100+1比例。在起初的10~ 15个循环中主要产物还是双链DNA.但当低浓度引物被消耗尽后。高浓度引物介导的PCR反应就会产生大量单链DNA.
应用:可制备单链DNA部分片段用于序列分析或核酸杂交的探针。
反转录PCR(reverse tranion, RT- PCR技术
当扩增模板为RNA时。需先通过反转录酶将其反转录为cDNA才能进行扩增。RT - PCR应用非常广泛。无论是分子生物学还是临床检验等都经常采用。
修饰引物PCR技术
为达到某些特殊应用目的.如定向克1隆、定1点突变、体外转录及序列分析等。可在引物的5*-端
加上酶切位点、突变序列、转录启动子及序列分析结合位点等。
低严格单链特异性引物PCR (Lowstringencysingle specific primer PCR, LSSP- PGR)技术
LSSP - PCR是建立在PCR基础上的又一种新型基因突变检测技术。要求是“二高一低”。高浓度
的单链引物( 5-端/ 3-端引物均可).约4. 8Lmol高浓度的Taq酶( 16Lmol/ 100ml) 低退火温度( 300.所用的模板必须是纯化的DNA部分片段。在这种低严格条件下。引物与模板间发生不同程度的错配。形成多种大小不同的扩增产物。经电泳分离后形成不同的带型。对同一目的基因而言。所形成的带型是固定的。因而称之为“基因标签”。这是一种检测基因突变或进行遗传鉴定的敏感方法。
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