基因的分子手术是相当复杂的过程，其中zui重要的是连接酶
互补碱基之间的配对，形成双链。并在DNA连接酶的作用下，使同一DNA分子的两端连接成环状，或使两个分子连成一大的线状分子。不同限制性内切酶切割DNA产生的三种不同类型的末端。
基因的分子手术是相当复杂的过程，除了需要限制性内切酶外，还需要其他- -些工具酶包括连接酶、DNA 聚合酶、RNA聚合酶、核酸酶、
感受态细胞制备试剂
基因的分子手术是相当复杂的过程，其中zui重要的是连接酶
互补碱基之间的配对，形成双链。并在DNA连接酶的作用下，使同一DNA分子的两端连接成环状，或使两个分子连成一大的线状分子。不同限制性内切酶切割DNA产生的三种不同类型的末端。
基因的分子手术是相当复杂的过程，除了需要限制性内切酶外，还需要其他- -些工具酶包括连接酶、DNA 聚合酶、RNA聚合酶、核酸酶、末端修饰酶等，对DNA或RNA进行各种各样的修饰。其中zui重要的是连接酶。
T4 RNA Ligase主要用于RNA和RNA之间的连接，连接时需要5'磷酸基团和3'羟基的存在。不仅可以进行RNA分子间的连接，也可以进行RNA分子(zui短8个碱基)的环化连接。
T4 RNA Ligase可以用于RNA和单核苷酸之间的连接，单核苷酸必须为5'和3'均磷酸化的形式，此时常用于RNA的3'末端标记。
T4 RNA Ligase也可以用于DNA和RNA之间的连接。当DNA提供5'磷酸基团，RNA提供3'羟基时，连接效率较高；当DNA提供3'羟基，RNA提供5'磷酸基团时，连接效率非常低。
T4 RNA Ligase也可以用于DNA和DNA之间的连接，但连接效率非常低。主要用于DNA的环化连接，例如5' RACE中的cDNA环化。DNA和DNA之间的连接尽管可以进行，但比较困难。
DNA新链的延伸由DNA聚合酶 III所催化。为了copy的不断进行，解旋酶须沿着模板前进, 边移动边解开双链。由于DNA的解链，在DNA双链区势必产生正超螺旋，在环状DNA中更为明显，当达到一定程度后就可能造成copy叉难以再继续前进，但在细胞内DNA的copy不会因出现拓扑学问题而停止，因为拓扑异构酶会解决这一问题。
随着引发体合成RNA引物，DNA聚合酶 III开始不断地将引物延伸，合成DNA。DNA聚合酶 III是一个多亚基复合二聚体，一个单体用于前导链的合成，另一个单体用于滞后链的合成，因此它可以在同一时间分别copyDNA前导链和滞后链。虽然DNA前导链和滞后链copy的方向不同，但如果滞后链模板环绕DNA聚合酶III,并通过DNA聚合酶 III,然后再折向未解链的双链DNA的方向，则滞后链的合成可以和前导链的合成在同一方向进行。
所有合成cDNA条链的方法都要用依赖于RNA的DNA聚合酶(反转录酶)来催化反应，主要有两个关键因素，一个是mRNA模板，另一个是反转录酶 。商品化反转录酶有从禽类成髓细胞瘤病毒纯化到的禽类成髓细胞病毒（AMV）逆转录酶和从表达化的Moloney鼠病毒反转录酶基因的大肠中分离到的鼠病毒（MLV）反转录酶。AMV反转录酶包括2个具有若干种酶活性的多肽亚基，这些活性包括依赖于RNA的DNA合成，依赖于DNA的DNA合成以及对DNA-RNA杂交体的RNA部分进行内切降解（RNA酶H活性）。MLV反转录酶只有单个多肽亚基，兼备依赖于RNA和依赖于DNA的DNA合成活性，但降解DNA—RNA杂交体中的RNA的能力较弱。且其热稳定性较AMV反转录酶差。MLV反转录酶能合成较长的eDNA（如大于2～3kb）。AMV反转录酶和MI。V反转录酶利用RNA模板合成cDNA时的适pH、适盐浓度和适温度各不相同．所以合成链时相应调整条件是非常重要的。
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