限制性核酸内切酶是可以识别特定的DNA序列，并在每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类酶，简称限制酶。
在基因工程中的作用是，1可以用于切割DNA，把目的基因从一个DNA分子中切割下来，2可以用于对运载体的修饰和改造；3可以用于基因表达载体的构建，即用同一种限制酶切割目的基因和运载体，产生相同的粘性末端，以便进一步连接。
限制性内切酶能特异
内切酶
限制性核酸内切酶是可以识别特定的DNA序列，并在每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类酶，简称限制酶。
在基因工程中的作用是，1可以用于切割DNA，把目的基因从一个DNA分子中切割下来，2可以用于对运载体的修饰和改造；3可以用于基因表达载体的构建，即用同一种限制酶切割目的基因和运载体，产生相同的粘性末端，以便进一步连接。
限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链DNA。它可分为三类：
Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰（甲1基化）作用且依赖于ATP的存在。Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA分子，然后从底物上解离。
Ⅱ类由两种酶组成： 一种为限制性内切核酸酶（限制酶），它切割某一特异的核苷酸序列； 另一种为独立的甲1基化酶，它修饰同一识别序列。Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克1隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础。绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列（如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列：5'- G↓AATTC-3'），有少数酶识别更长的序列或简并序列。Ⅱ类酶切割位点在识别序列中，有的在对称轴处切割，产生平末端的DNA部分片段（如SmaⅠ：5'-CCC↓GGG-3'）；有的切割位点在对称轴一侧，产生带有单链突出末端的DNA部分片段称粘性末端，如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。
DNA限制性内切酶酶切
影响条件：DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性。大部分限制性内切酶不受RNA或单链DNA的影响。
处理方法：当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时，会影响其进一步使用，因此在吸取限制性内切酶时，每次都要用新的吸管头。如果采用两种限制性内切酶，必须要注意分别提供各自的zui适盐浓度。若两者可用同一缓冲液，则可同时水解。若需要不同的盐浓度，则低盐浓度的限制性内切酶必须首先使用，随后调节盐浓度，再用高盐浓度的限制性内切酶水解。也可在第yi个酶切反应完成后，用等体积酚/氯1仿抽提，加0.1倍体积3mol/L NaAc和2倍体积无水乙醇，混匀后置-70℃低温冰箱30分钟，离心、干燥并重新溶于缓冲液后进行第二个酶切反应。
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