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如何用制备色谱柱制备低含量的杂质？

制备色谱柱为ZorbaxSB-C18 9.4*250mm及gilson馏分收集器，色谱仪为Agilent1100或LC-6A。想用其制备面积归一化法含量为0.05%左右的杂质，初步提纯后用高分辨的LC-MS进行定性分析。如何设定色谱条件，如，流量、进样量、样品的浓度、切割点的设置、是否要浓缩，要求将95%以上的主峰切除。

（主峰后有二个杂质靠得很近。）

答：

1.制备用的流动相尽量等级高一点，否则流动相中的杂质会影响LC-MS分析。

2.使用馏分收集器时，延迟体积一定要计算准确，检测器的响应时间设到很小，否则都会影响收集的纯度和回收率。制备柱的流速一般与直径的平方成正比，如果4.6mm分析柱流速为1mL/min，9.4mm制备柱用1*（9.4/4.6）2,大约为4mL/min。进样量设到几个mg应该基本没有过载。进样样品浓度越高越好。假如进样10mg，理论计算0.05%的杂质大约只有5μg，显然浓度太低，尽量是多做几次，合并馏分然后浓缩后做LC-MS分析。

工业制备色谱

蛋白质的特定构象对蛋白质的生物功能起决定性的作用。而几乎所有的蛋白质必须与其他分子相结合才能发挥其功能和作用。当蛋白质的构象发生变化，例如通过加热或化学试剂处理等使多肽链的盘绕和折叠被解开，其空间结构发生变化， 则蛋白 质变性， 其功能和生物活性即丧失，作为现代生物科技的主要产品类型，蛋白质是结构和功能非常复杂的大分子。

常见色谱填料

色谱理论认为，不同的物质之间，只要存在物理、化学或生物学性质的差异，就会在不同的物相上具有不同分配系数，即可在色谱过程中得到分离、分析或测定。如果说，色谱柱是进行色谱分离的主要场所，人们常将其比喻为色谱仪的心脏；那么，色谱填料就是组成心脏的一个个细胞，因此，色谱填料的性质决定了色谱柱的性能。

根据不同的基质，色谱填料可分为：有机聚合物填料、无机基质填料、有机-无机复合型填料。目前，无机基质填料仍牢牢占据大部分市场，主要包括硅胶、氧化铝、羟基磷灰石、活性碳等。