大鼠shen小球内皮细胞分离培养
2.原代细胞培养:(1)shen脏原位灌洗:SD大鼠用25%乌拉坦腹整注射麻zui后仰卧固定。胸腹部消森并分离胸主动脉,以无菌的冷Hank液漱朱洗血.同时剪破shen静脉利于液体流出。结果:30%percoll密度梯度离心前CD117(c-kit)阳性细胞占13。1-2min后shen脏色泽变白,取出双shen冰浴保存。
(2)sh
癌细胞
大鼠shen小球内皮细胞分离培养
2.原代细胞培养:(1)shen脏原位灌洗:SD大鼠用25%乌拉坦腹整注射麻zui后仰卧固定。胸腹部消森并分离胸主动脉,以无菌的冷Hank液漱朱洗血.同时剪破shen静脉利于液体流出。结果:30%percoll密度梯度离心前CD117(c-kit)阳性细胞占13。1-2min后shen脏色泽变白,取出双shen冰浴保存。
(2)shen小球分离:参照Green等方法改进。将灌洗后的shen脏撕下shen被膜.去除髓质后将皮质剪成约1-2mm'的碎块，轻碾shen皮质依次通过80.120和200目钢筛。收集shen小球。
(3)shen小球消化和培养；将提取的shen小球加人0.1% IN 型胶原酶消化后收集沉淀。以2x10* 的shen小球数接种于铺有1%明胶培养瓶内,加A配制好的内皮细胞培养液(MFM.Hepes 20 mmnoVL 20%胎牛xue清0. 66 U胰岛素/ml.血管内皮生长因子20 ng /ml、肝素钠100 u/ml.青莓su100 U/ml、链霉su100 μ/ml) .静止培养3 d后逐日观察shen小球的贴壁情况。待shen小球充分贴壁后常规换液.第3同进行纯化。间接标记有放大作用,因此可在磁性分选抗原表达弱的目的细胞时使用。
脂质体瞬时转染
1、细胞H9C2 (Hela) 6孔板Hela1x10°/孔。
2、转染前换上没有抗sheng素的DMEM+胎清(10%)。
3、将质粒DNA (约2-4ul) 2ul 加入dorf管中+DMEM至50u1。
4、脂质体5ul补培养基至50ul混匀静止5分钟(质粒与脂质体比例为1:2或1.5:2.5)。
5、将含有脂质体的培养基与含质粒的混合总体积100ul室温放置30分钟。
6、吸取混合物均匀加入每一个孔中。
7、将6孔板放入培养箱中继续培养6小时后吸出培养基换上新配置的培养基DMEM6ml+胎清600u1+三抗300u1。
8、培养24小时。
大鼠gu髓间充质gan细胞的分离
操作方法
(1 )取SD大鼠( 2周龄)，颈椎脱臼法处死后立即用75%乙醇浸泡，移入超净工作台内，用大头针固定大鼠四肢于工作台面的泡沫板上。
(2)碘酒擦拭四肢，再用酒精棉球擦拭，无菌条件下用灭菌消毒后的镊子和剪刀分离出大鼠股骨和胫骨，剔除骨头表面肌肉, PBS溶液冲洗两遍。
(3 )从中间剪断股骨和胫骨，用2ml无菌注she器吸取DMEM/F 12溶液冲出gu髓细胞多次，再用针头吹打，吸管吸入离心管内，1000r/min离心5min，弃上清，用PBS重悬细胞。
(4 )缓慢将细胞悬液加入预先装有5mL淋巴细胞分离液的15mL离心管内，保持细胞悬液在淋巴细胞分离液上层，注意不要搅动液面,保持二者分层界面。
(5 ) 2000rpm离心15-25min，离心后溶液分4层，吸取中间骨sui基质细胞层(白色浑浊状)， PBS洗三次。
(6)用含15%胎牛xue清及青链mei素的DMEM/F 12以106/mL的细胞浓度接种于25cm2培养瓶中， 置37°C、5%CO2恒温培养箱中培养。
( 7 ) 24小时后弃去培养液(看细胞贴壁情况)，PBS冲洗2-3次去除末贴壁细胞，加入培养液继续培养。以后每3d半量换液1次，-般10d细胞生长融合。
(8 )经0.25%胰酶消化，1 : 2传代，其后一般3-5d传代1次,选取生长良好的第三代细胞进行后续实验。
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