阳性对照和阴性对照的体外GTPγS/ GDP蛋白质上样量
注意：体内细胞刺激将激l活可用Arf 6的大约10％，而体外GTPγS蛋白负载将激l活Arf 6的将近90％。
1，将0.5 ml每种细胞提取物等分到两个微量离心管中（或使用1 μg纯化的Arf 6蛋白）。
2，向每个试管中加入20 μl 0.5 M EDTA（终浓度为20
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阳性对照和阴性对照的体外GTPγS/ GDP蛋白质上样量
注意：体内细胞刺激将激l活可用Arf 6的大约10％，而体外GTPγS蛋白负载将激l活Arf 6的将近90％。
1，将0.5 ml每种细胞提取物等分到两个微量离心管中（或使用1 μg纯化的Arf 6
蛋白）。
2，向每个试管中加入20 μl 0.5 M EDTA（终浓度为20 mM）。
3，将5 μl 100 XGTPγS（至100 μM，终浓度）加到一个试管中（阳性对照）。
4，在第二个试管中加入5 μl 100 X GDP（至1 mM，终浓度）（阴性对照）。
5，在搅拌下将试管在30°C孵育30分钟。
6，通过将试管放在冰上并添加32.5 μl 1 M MgCl2（至60 mM，终浓度）来停止加载。
武汉纽斯特生物科技有限公司（WuhanNewEastBiotechonologyCo.Ltd），系美国生命科学试剂供应商美国NewEastBio在的子公司。美国NewEastBio专注于生命科学和生物技术领域，主要产品有小分子、ELISA试剂盒、蛋白等。
悬浮细胞
1.培养细胞并根据需要用活化剂或抑制l剂刺激。
2.进行细胞计数，然后通过离心沉淀细胞。
3.吸出培养基，并用冰冷的PBS洗涤两次。
4.完全除去PBS洗涤液，然后向细胞沉淀中加入冰冷的1X分析/裂解缓冲液
（每1 x 107池0.5 – 1 mL）。
5.通过重复移液裂解细胞。
6.将裂解物转移至适当大小的试管中，并置于冰上。
7.如果发生核裂解，则细胞裂解液可能变得非常粘稠，难以移液。如果这
发生时，裂解液可通过27号注射l器针头3-4次以剪切
基因组DNA。
8.通过离心10分钟（在4°C下为12,000 x g）清除裂解物。
9.收集上清液并将样品保存在冰上以备立即使用，或速冻并保存在-
70°C以备将来使用。
阳性和阴性对照的体外GTPγS/ GDP蛋白质上样量
注意：体内刺激细胞会激l活大约10％的可用Rab35，而
体外GTPγS蛋白负载将激l活近90％的Rab35。
1.将0.5 ml每种细胞提取物等分到两个微量离心管中（或使用1 μg纯化的Rab35蛋白）。
2.向每个试管中加入20 μl 0.5 M EDTA（至20 mM终浓度）。
3.将5 μl 100 XGTPγS（至100 μM，终浓度）加到一个试管中（阳性对照）。
4.在第二个试管中加入5 μl 100 X GDP（至1 mM，终浓度）（阴性对照）。
5.在搅拌下将试管在30°C孵育30分钟。
6.通过将试管放在冰上并添加32.5 μl 1 M MgCl2（至60 mM
）。
Gα13活化试验。MEF细胞分别用LPA（第2道）或不加LPA（1道）处理。细胞裂解物
用抗活性Gα13单克l隆抗l体（Cat）孵育。#26902）（顶面板）。这个用抗Gα13兔多克l隆抗l体（Cat）免l疫印迹法检测沉淀活性Gα13#21005年）。底部的面板显示了用抗Gα13的细胞裂解物的Western blot（5%在顶部面板中使用的）。
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