植物的遗传转化是以植物器1官、组织、细胞或原生质体作为受体,通过某种技术或途径转入外源基因,获得外源基因稳定表达的可育植株。遗传转化可以打破物种界限,有目的地实现物种之间或物种内部遗传物质的交流,为植物的遗传改良开辟了一条新的途径。
植物遗传转化方法就是通过特定的方式将外源基因导入到受体细胞内,使之发生定向的遗传变异。目前,已经建立了多种转化系统。对于大多数遗
腺病毒浓缩
植物的遗传转化是以植物器1官、组织、细胞或原生质体作为受体,通过某种技术或途径转入外源基因,获得外源基因稳定表达的可育植株。遗传转化可以打破物种界限,有目的地实现物种之间或物种内部遗传物质的交流,为植物的遗传改良开辟了一条新的途径。
植物遗传转化方法就是通过特定的方式将外源基因导入到受体细胞内,使之发生定向的遗传变异。目前,已经建立了多种转化系统。对于大多数遗传转化系统而言,遗传转化方法是遗传转化系统的关键环节,决定着转化的成败及效率。用于植物的遗传转化方法有许多:农杆1菌介导法、基因枪法和PEG法等。
在转0基因植物中,用农杆1菌介导法获得的转0基因植物占80%,但大多集中在双子叶植物上。自从基因枪问世以后,单子叶植物中的禾谷类作物的遗传转化获得了迅速发展。农杆1菌介导法和基因枪法已成为目前用于遗传转化的主要方法。
农bacillus转化法
农bacillus包括引起植物冠瘿瘤的根癌农bacillus和引起发根病的发根农杆1菌。根癌农杆1菌和发根农bacillus有相似的遗传背景。在农bacillus介导的转化中,80%左右是由根癌农bacillus介导的,大约20%是由发根农bacillus介导的。这里主要介绍根癌农杆1菌介导的转化。
根癌农bacillusTi质粒上有一段转移DNA(T-DNA)和Vir区,在农bacillus侵染植物时,这段T-DNA可以插入到植物基因组中,使其携带的基因在植物中得以表达。Vir区共24个基因,它们表达的蛋白与T-DNA的加工和转移有关。
腺病毒载体的构建经历了体外直接连接、包装细胞内重组、细菌内重组、位点特异性重组4个发展阶段,同时随着分子生物学技术的发展,改进的体外连接法又得到应用。
体外连接法。这种方法需要全长腺病毒基因组和一个含腺病毒基因组左末端序列的质粒,包括左端反向末端重复(Inverted terminal repeat,ITR)、包装信号和E1A的增强子序列。将目的基因克1隆到质粒的病毒序列下游,ClaI酶切获得含目的基因的基因组左末端,连接到ClaI酶解的野1生型腺病毒基因组(ClaI在病毒基因组仅有一个酶切位点,位于E1A基因内部),将得到的含目的基因的的基因组DNA直接转染包装细胞293,产生重组病毒颗粒。这种方法需要培养野1生型腺病毒以提取病毒基因组,能够使用的酶切位点仅有一个,连接效率低,而且仅删除了部分E1A基因,外源基因载量有限,所以现已淘汰不用。
腺病毒的分类
分类及自上个世纪50年代发现并成功分离腺病毒以来,已陆续发现了100余个血1清型,其中人腺病毒有52种,分为A、B、C、D、E和F六个亚群(subgroup)。基因cure常用的人的2型及5型腺病毒在血1清学分类上均属C亚群,在DNA序列上有95%的同源性。二者的增殖能力非常强,滴度通常可以达到109pfu (plaque forming unit)/ml,其在单个细胞中的基因组拷贝数可达104(约占细胞总DNA的10%)。病毒颗粒比较稳定,通过CsCl梯度离心可以达到1010~1011pfu/ml,满足动物实验的要求。
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