分子实验介绍——荧光定量PCR检测
荧光定量PCR是检测生物样品中RNA含量的普遍的方法，通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。竞争实验中采用含蛋白结合序列的DNA或RN片duan和gua核苷酸片段（特异），和其它非相关的片段（非特异），来确定DNA或RNA结合蛋
PCR实验室
分子实验介绍——荧光定量PCR检测
荧光定量PCR是检测生物样品中RNA含量的普遍的方法，通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。竞争实验中采用含蛋白结合序列的DNA或RN片duan和gua核苷酸片段（特异），和其它非相关的片段（非特异），来确定DNA或RNA结合蛋白的特异性。目前主要使用Sybr green和taqman法对RNA含量进行检测。Sybr green在低样本量时成本较低，目前选用的较多。
SYBR Green I是一种只与DNA双链结合的荧光染料。蛋白质上样浓度不要超过10mg/mL,否则会造成蛋白质的聚集或沉淀。当它与DNA双链结合时，发出荧光；从DNA双链上释放出来时，荧光信号急剧减弱。因此，在一个体系内，其信号强度代表了双链DNA分子的数量。SYBR Green荧光染料法定量PCR的基本过程是：1、开始反应，当SYBR Green染料与DNA双链结合时发出荧光。2、DNA变性时，SYBR Green染料释放出来，荧光急剧减少。3、在聚合延伸过程中，引物退火并形成PCR产物。4、聚合完成后，SYBR Green染料与双链产物结合，定量PCR系统检测到荧光的净增量加大。
实验流程：细胞或组织RNA提取-RNA浓度检测-RNA逆转录-定量PCR检测。
结果示例：
图 A 基因扩增曲线图；B 基因扩增溶解曲线图；C mRNA相对表达量变化
从图中可以扩增曲线可以看出目的RNA扩增效果，溶解曲线可以看出引物识别特异性情况，通过使用ΔΔCt方法计算可以得到每个组中目的mRNA表达变化。
microRNA芯片:
RNA干扰(RNA Interference, RNAi)现象是一种进化上保守的抵御或外来病毒qin犯的防御机制。腺相关病毒的滴度在10^12~10^13GC/ml,可以满足各类整体实验的使用要求。将含有靶基因mRNA同源互补序列的RNA（Double strand RNA， dsRNA）导入细胞后，能够特异地识别该mRNA，引起mRNA的降解，从而导致相应的功能缺失。RNAi提供了一种经济、快捷、gao效的抑制特异基因表达的技术手段,该技术已被广泛用于研究基因功能和chuan染性疾病及恶xingzhong瘤基因zhi疗领域。目前常用的RNA干扰手段为miRNA、 shRNA和siRNA等。
MiRNA是一类可以通过RNAi机制调节基因表达的内源性小RNA，人工miRNA与shRNA的设计原理基本相同，由于miRNA具有内源性，因此其更易产生有效的基因沉默。
技术流程：
dsRNA或pre-miRNA被导入细胞后，能够被一种特异的核酸内切酶（Dicer）识别并切割成为小片段，这些片段在RNA解旋酶的作用下解链。高l效液相色谱(High-performanceLiquidChromatography,HPLC)HPLC是--种比较传统的方法,是根据DNA或蛋白分子量和构象的不同而使其加以分离。继之反义链在与体内一些酶（包括内切酶、外切酶、解旋酶等）结合形成RNA诱导的沉默复合物（RNA-Induced Silencing Complex，RISC），RISC与mRNA同源区进行特异性结合，若miRNA与mRNA的结合位点配对，则切割mRNA；若miRNA与mRNA的结合位点不配对，则抑制mRNA的翻译。
线粒体测序
线粒体是真核生物的重要细胞器，是生物体的能量工厂，参与能量代谢、信号转导、细胞凋亡等许多生命活动，对生物的生理活动起着至关重要的作用。腺病毒包装原理介绍腺病毒是一种没有包膜的直径为79-90nm的颗粒，由252个壳粒呈二十面体排列构成。大部分线粒体基因由于其母系遗传特性以及进化速率较快等特点，被广泛地用于种群遗传学、进化生物学、谱系地理学和系统发育学、疾病诊断等学科领域。线粒体全基因组在生物进化的研究中具有的优势。由于线粒体有着与真核生物长期共生的进化历史，因此其基因组包含了反映物种进化的关键信息，同时，相对于核基因组，线粒体基因组小，容易对大量物种进行横向的比较分析，有利于生物进化的研究，因而受到进化生物学家的钟爱。线粒体的组成可以从两个层面上反映物种及群体的遗传和进化，即核酸序列组成和基因组的结构特征，两者的特征具有不同的进化机制和进化速度，在进化生物学研究中可以很好的互补。
3、参数设置
使用488nm激发波长，525nm发射波长，实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱。DCF的荧光光谱和FITC非常相似，可以用FITC的参数设置检测DCF。DCF的激发光谱和发射光谱参考下图。
4、其它说明
阳性对照可以按照1：1000的比例使用。在逆转录酶的作用下，以病毒RNA为模板合成cDNA再通过DNA、转录、翻译等过程形成病毒颗粒。例如装载好探针的细胞共1毫升，可以加入1微升的阳性对照刺激。通常刺激后20-30分钟内可以观察到非常显著的活性氧水平升高。对于不同的细胞，活性氧阳性对照的效果可能有较大的差别。如果在刺激后30分钟内观察不到活性氧的升高，可以适当提高活性氧阳性对照的浓度。如果活性氧升高得过快，可以适当降低活性氧阳性对照的浓度。
另外，对于某些细胞，如果发现没有刺激的阴性对照细胞荧光也比较强，可以按照1：2000-1：5000稀释DCFH-DA，使装载探针时DCFH-DA的浓度为2-5微摩尔/升。探针装载的时间也可以根据情况在15-60分钟内适当进行调整。
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