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细胞冻存的操作步骤

1. 配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血的冻存培养液；

2. 取对数生长期的细胞，去除旧培养液，用PBS清洗。

3. 去除PBS，加入适量胰蛋白酶（覆盖培养皿表面）把单层生长的细胞消化下来；

4. 离心1000rpm，5min；

5. 去除胰蛋白酶，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的密度为5×106/ml～1×107/ml；

6. 将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5 ml；

7. 在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者；

8. 冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/ min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h ，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。

使用冻存袋的注意事项

1、使用冻存袋储存样本时，严格要求应把冻存袋放入液氮的气相层或冰箱中保存！如果冻存袋储存于液氮液体中，液氮有一定几率会渗入冻存袋内部，复苏时液氮气化导致管内外压力不平衡，这样极易造成冻存管的炸裂，并具有生物危害性。

2、冻存的样本量不要超过冻存袋要求的大工作体积。

3、用毕暂时不再使用时，应洗净并擦净活栓，在活栓处应垫一纸条，以防粘连。

细胞冻存步骤

（1）将标本编号，并用Marker笔仔细标注于冻存管管盖及管壁上，同时将每管编号、内容物、取材日期记录于登记本上。

（2）将冻存管装入冻存袋，戴上棉线手套和防护面罩，迅速放入液氮罐中30～60秒速冻，至冻存组织完全冻住，取出待液氮完全挥发（注意动作轻柔，避免液氮溅洒）。

（3）将经液氮速冻后的组织放入-80℃冰箱相应编号盒中，长期保存。

（4）取材完毕后，将剩余新鲜标本浸泡于10%中尔马林液中固定（切记不要拿错病理号），做好和当日冰冻值班医生的交接，避免遗漏。

（5）清洗取材台及取材器具，器具需用消毒液完全浸泡10～15min，清水冲洗后擦干置于干燥处保存备用，取材器具应定期高温消毒。