聚合酶链式反应(PCR)是一种用于放大扩增特定的DNA部分片段的分子生物学技术,它可看作是生物体外的特殊DNA copy,PCR的zui大特点是能将微量的DNA大幅增加。因此,无论是化石中的古生物、历史人物的残骸,还是几十年前凶1杀案中凶1手所遗留的毛发、皮肤或血液,只要能分离出一丁点的DNA,就能用PCR加以放大,进行比对。这也是“微量证据”的威力之所在。由1983年美国
全能PCR酶
聚合酶链式反应(PCR)是一种用于放大扩增特定的DNA部分片段的分子生物学技术,它可看作是生物体外的特殊DNA copy,PCR的zui大特点是能将微量的DNA大幅增加。因此,无论是化石中的古生物、历史人物的残骸,还是几十年前凶1杀案中凶1手所遗留的毛发、皮肤或血液,只要能分离出一丁点的DNA,就能用PCR加以放大,进行比对。这也是“微量证据”的威力之所在。由1983年美国Mullis首先提出设想,1985年由其发明了聚合酶链反应,即简易DNA扩增法,意味着PCR技术的真正诞生。到如今2013年,PCR已发展到第三代技术。1976年,科学家钱嘉韵,发现了稳定的Taq DNA聚合酶,为PCR技术发展也做出了基础性贡献。
Hot Start PCR的原理
Hot Start PCR法是提高PCR特异性的重要方法之一。这种方法可以防止在PCR反应第yi步骤因引物的错配或引物二聚体的形成而导致的非特异性扩增,从而可以提高目的DNA部分片段的扩增效率。TaKaRa Taq Hot Start Version,TaKaRa Ex Taq Hot Start Version,TaKaRa LA Taq Hot Start Version,PrimeSTAR HS DNA polymerase,MightyAmp DNA Polymerase是抗1体和DNA聚合酶的混合制品。抗1体在高温加热前与聚合酶相结合,抑制聚合酶的活性。在PCR反应zui初的DNA变性步骤,抗1体变性,聚合酶活性恢复。
竞争性PCR(competitive PCR, c-PCR技术
c-PCR技术是竞争cDNA模板与目的cDNA同时扩增.使用同样的引物,但一经扩增后。能从这些
目的cDNA区别开来。通常使用突变性竞争cDNA模板.其序列与目的cDNA序列相同.不过模板中仅有一个新内切位点或缺少内切位点突变性的cDNA模板可用适当的内切酶水解,并用分光计测定其浓度。cDNA目的序列和竞争模板相对应的含量.可用澳化乙锭染色.电泳胶直接扫描进行测定或掺入放1射性同位素标记的方法测定。竞争模板开始时的浓度是已知的.则cDNA目的序列的zui初浓度就能测定。这种方法能准确测定mRNA中cDNA靶序列.可用于几个到10个细胞中mRNA的定量。
目前的病毒核酸检测试剂盒,多数采用荧光定量PCR方法,通过检测荧光信号的累积来确定样本中是否含有病毒核酸。那么,核酸检测到底需要经过哪些步骤呢?概括起来,是 取样、留样、保存、核酸提取和上机检测五个步骤。
取样
采集人体的分泌物。用鼻咽拭子或咽拭子擦拭鼻腔或咽后壁及双侧扁桃体处
留样
将拭子头浸入细胞保存液中,折断尾部后立即旋紧管盖
保存
将样本管放入密封袋中保存好,并及时送检
核酸提取
将样本送进实验室进行核酸提取
上机检测
将提取物进行荧光PCR扩增反应
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