PCR的创建
Khorana (1971)等zui早提出核酸体外扩增的设想:“经DNA变性,与合适的引物杂交,用DNA聚合酶延伸引物,并不断重复该过程便可合成tRNA基因。”但由于当时基因序列分析方法尚未成熟,热稳定DNA聚合酶尚未报道以及引物合成的困难,这种想法似乎没有实际意义。加上分子克1隆技术的出现提供了一种克1隆和扩增基因的途径,所以Khorana的设想被人们
含基因组DNA去除试剂盒
PCR的创建
Khorana (1971)等zui早提出核酸体外扩增的设想:“经DNA变性,与合适的引物杂交,用DNA聚合酶延伸引物,并不断重复该过程便可合成tRNA基因。”但由于当时基因序列分析方法尚未成熟,热稳定DNA聚合酶尚未报道以及引物合成的困难,这种想法似乎没有实际意义。加上分子克1隆技术的出现提供了一种克1隆和扩增基因的途径,所以Khorana的设想被人们遗忘了。
1983年4月的一个星期五晚上,他开车去乡下别墅的路上,猛然闪现出“多聚酶链式反应”的想法。
1983年12月,Mullis用同位素标记法看到了10个循环后的49 bp长度的第yi个PCR片段;
1985年,Kary Mullis在Cetus公司工作期间,发明了PCR。Mullis要合成DNA引物来进行测序工作,却常为没有足够多的模板DNA而烦恼。
1985年10月25日申请了PCR的专1利,
1987年7月28日批准(专1利号4,683,202 ),Mullis是第yi个发明人;
1985年12月20日在Science杂志上发表了第yi篇PCR的学术论1文,Mullis是共同作者;
1986年5月,Mullis在冷泉港实验室做专题报告,全世界从此开始学习PCR的方法。
PCR反应特点
灵敏度高:PCR产物的生成量是以指数方式增加的,能将皮克(pg=10-12)量级的起始待测模板扩增到微克(μg=-6)水平。能从100万个细胞中检出一个靶1细胞;在病毒的检测中,PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位);在细菌学中zui小检出率为3个细菌。
简便、:PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶,一次性地将反应液加好后,即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应,一般在2~4 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析,不一定要用同位素,无放1射性污染、易推广。
纯度要求低:不需要分离病毒或细菌及培养细胞,DNA 粗制品及RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等DNA扩增检测。
竞争性PCR(competitive PCR, c-PCR技术
c-PCR技术是竞争cDNA模板与目的cDNA同时扩增.使用同样的引物,但一经扩增后。能从这些
目的cDNA区别开来。通常使用突变性竞争cDNA模板.其序列与目的cDNA序列相同.不过模板中仅有一个新内切位点或缺少内切位点突变性的cDNA模板可用适当的内切酶水解,并用分光计测定其浓度。cDNA目的序列和竞争模板相对应的含量.可用澳化乙锭染色.电泳胶直接扫描进行测定或掺入放1射性同位素标记的方法测定。竞争模板开始时的浓度是已知的.则cDNA目的序列的zui初浓度就能测定。这种方法能准确测定mRNA中cDNA靶序列.可用于几个到10个细胞中mRNA的定量。
普通的PCR仪
把一次PCR扩增只能运行一个特定退火温度的PCR仪,叫传统的PCR仪,也叫普通PCR仪。
它是由主机,加热模块,PCR管,热盖,控制软件组成。根据DNA部分片段高温解链,降温配对聚合原理,通过循环改变加热模块的温度,微量不易于分辨的的DNA部分片段进行扩增成大量的DNA部分片段,从而对其进行分析鉴定。根据需要可结合电泳仪,水平电泳槽,一起应用。如果要做不同的退火温度需要多次运行。主要是做简单的,对目的基因退火温度的扩增。
该仪器主要应用于医学临床检验,食品检测,科研机构,高等院校教学对遗传变异,基因表达等进行研究。

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