低温生物菌种——制备
也称种子制备，是指菌种在一定条件下，经过扩大培养成为具有一定数量和质量的纯生产菌种的制备过程。以作接入发酵罐中进一步扩大菌体量及合成产物之用。种子制备包括孢子制备和菌丝体制备（见图），其中(1)～(4)为孢子制备过程。保存在沙土管或冷冻管中的生产菌种，用无菌手续挑取少许，接入琼脂斜面培养基上，在25℃（或较高温度）下培养5～7天(或较长时间)。所得孢
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低温生物菌种——制备
也称种子制备，是指菌种在一定条件下，经过扩大培养成为具有一定数量和质量的纯生产菌种的制备过程。以作接入发酵罐中进一步扩大菌体量及合成产物之用。种子制备包括孢子制备和菌丝体制备（见图），其中(1)～(4)为孢子制备过程。保存在沙土管或冷冻管中的生产菌种，用无菌手续挑取少许，接入琼脂斜面培养基上，在25℃（或较高温度）下培养5～7天(或较长时间)。所得孢子还需进一步用较大表面积的固体培养基以获得更多孢子，对于霉菌类孢子制备，多数采用大米、小米之类的天然培养基。将培养成熟的斜面孢子制成悬浮液，接种到扁瓶固体培养基上，于25～28℃培养14天。将成熟的扁瓶孢子于真空中抽干，使水分降至10%以下，并放入 4℃冰箱中备用。一次制得的孢子瓶可在生产上延续使用半年左右。菌孢子的培养基大多是采用麸皮或豌豆浸出液、牛肉膏及无机盐与琼脂制成的。将斜面孢子接入扩大的扁瓶孢子培养基中,于28～37℃培养5～14天。所获得的大量孢子可直接作为种子罐 (6)的种子。如果有些生产菌种不产孢子，如产生菌或产孢子不多的,则可采用摇瓶（5）液体培养制得菌丝体，作种子罐的种子。种子罐的目的是使接入有限的孢子或菌丝体迅速发芽、生长、繁殖成大量菌体。其中的培养基组分应是易于被菌体利用的碳源（如葡萄糖）和氮源（如玉米浆等）,及无机盐(如磷酸盐)等。作为发酵罐(7)的种子应是生命力旺盛、染色深、菌丝粗壮,无杂菌及异常菌体。接种量一般在10%～20%。
低温生物菌种——菌种分离方法
寄主分离法即从生长有某种真菌的寄主体上（如茯苓、木耳木段）取下木片，进行分离的方法。如木耳制种时，可选朵大、出耳多、质厚的耳棒（即长有木耳的木段）。采集后，削去耳根下的树皮，将其横断面锯成1 厘米厚的木片，在无菌条件下，切去无耳菌丝部分，留下有耳菌丝部分，浸入水中1 分钟，取出再用无菌水冲去木片上的液体。然后，用解剖刀将木片切成0 . 5 厘米的小块，放入斜面培养基内，置24 ～26 ℃下培养，及时淘汰杂菌，选取纯菌丝进行移植培养，即得菌种。
生物有机肥产品生产使用现状
细菌类生产用除常见的芽孢外， 还出现了高地芽孢菌、 类干酪乳菌、 屎肠球菌、 盐居固氮菌等新， 其中， 高地芽孢菌和盐居固氮菌普遍存在于土壤环境中， 未见致病性报道， 属风险一级； 类干酪乳菌又名为副干酪乳菌， 虽为风险一级 ， 但有从动物受伤部位分离到该菌的报道；屎肠球菌属于乳酸菌类，属风险二级， 建议谨慎使用。伯克霍尔德氏菌是一些具有生物防治、 促进植物生长和生物修复等功能的细菌， 但同时也是可以引起鼻疽、 类鼻疽病的致病菌， 因此真菌伯克霍尔德氏菌属于风险三级， 需做致病性试验， 建议慎用或不用。真菌类生产用菌株主要为丝状真菌和酵母菌。哈茨木霉、 米曲霉、 淡紫紫孢菌、 长枝木霉、 绿色木霉、 棘孢木霉、 黑曲霉、 粉红螺旋聚孢霉、 金龟子绿僵菌等属于生物安全风险等级二级， 需按照NY/T 1109－2017 《微生物肥料生物安全通用技术准则》 进行毒理学测试。酵母菌主要以酿酒酵母为主， 还有少量东方伊萨酵母、杰丁塞伯林德纳氏酵母 （原产朊假丝酵母、 杰丁毕赤酵母）、 膜醭毕赤酵母、 解脂耶罗威亚酵母等， 属于生物安全风险等级一级， 可免做毒理学试验。
低温生物菌种——常用菌种介绍
巨大芽孢菌
巨大芽孢菌(Bacillus megaterium de Bary，1884)：杆状，末端圆，单个或呈短链排列。1.2-1.5×2.0-4.0微米，严格好氧，能运动，革兰氏阳性，芽孢1.0-1.2×1.5-2.0微米，椭圆形，中生或次端生 。芽孢从椭圆形到长形不等；不能生成乙酰；菌株能运动，但运动缓慢，需要游离氧；发酵葡萄糖产酸；DNA的G+C含量为36%-38%。
接触酶阳性；水解淀粉和酪素；V-P反应和卵黄反应阴性。琼脂平板微波状，平隆，浅黄白色转浅灰白色至浅灰褐色，表面略有光泽，在马铃薯块上生长，由浅黄灰色变为灰色。液化明胶慢、胨化牛奶、水解淀粉。
工业上用于生产葡萄糖异构酶，巨大芽孢菌在回收贵重金属方面有着重要作用，还能降解土壤中难溶的含磷化合物，使之成为作物能吸收的可溶物巨大芽孢菌与球形芽孢菌混合培养时具有固氮增效作用，非常适合制成微生物肥料。
巨大芽孢
