PCR引物设计的基本原则
引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。
引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。ATGC建议随机分布，避免5个以上的piao呤或嘧1啶核苷酸的成串排列参照。
引物内部不应出现互补序列。
两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3 ′端的互补重叠。
引物与非特
样品稀释液
PCR引物设计的基本原则
引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。
引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。ATGC建议随机分布，避免5个以上的piao呤或嘧1啶核苷酸的成串排列参照。
引物内部不应出现互补序列。
两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3 ′端的互补重叠。
引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%，
引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。引物3‘端的碱基，特别是zui末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，zui佳选择是G和C。
引物的5′端可以修饰。如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地1高辛标记，加入其它短序列，包括起始密码子、终止密码子等。
PCR出现假阴性
不出现扩增条带。PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及Br乙锭的使用， ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制1剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模板核酸变性不。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应 固定不宜随意更改。
PCR法不仅仅局限于分子生物学，还因其简便、迅速等特点被广泛应用于医学、法医学、食品、环境卫生检验、动植物检验等其它领域。Taq DNA聚合酶是PCR法普遍使用的聚合酶，但其具有如下局限性。
1. 可信度 (Fidelity)：通常Taq DNA Polymerase的Fidelity并不高，PCR反应有时会出现错配 (Misincorporation) 现象，因而PCR克1隆、变异导入等实验中，需加以注意。
2. 扩增的DNA长度：使用Taq DNA Polymerase进行PCR扩增时，通常可扩增几kb的DNA，超过10 kb则比较困难。这就给利用PCR进行Mapping等Genome解析带来麻烦。
3. 扩增量：使用Taq DNA Polymerase进行PCR产物克1隆及食品、环境卫生检验等时，扩增量常常达不到要求。为解决以上难题，Takara在对Polymerase、Buffer及反应条件等进行深入研究的基础上，开发了LA PCR (Long and Accurate PCR) 技术，运用此技术可大量正确地扩增长达40 kb 的DNA部分片段。LA PCR技术扩展了PCR的应用范围，可在Genome解析、基因诊断、长片段 DNA的克1隆及变异导入等方面发挥优势。
污染的监测
一个好的实验室，要时刻注意污染的监测，考虑有无污染是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染。
1、阳性对照：在建立PCR反应实验室及一般的检验单位都应设有PCR阳性对照，它是PCR反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志。阳性对照要选择扩增度中等、重复性好，经各种鉴定是该产物的标本，如以重组质粒为阳性对照，其含量宜低不宜高（100个拷贝以下）。但阳性对照尤其是重组质粒及高浓度阳性标本，其对检测或扩增样品污染的可能性很大。因而当某一PCR试剂经自己使用稳定，检验人员心中有数时，在以后的实验中可免设阳性对照。
2、阴性对照：每次PCR实验务必做阴性对照。它包括：
（1）标本对照：被检的标本是血1清就用鉴定后的正常血1清作对照；被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞作对照。
（2）试剂对照：在PCR试剂中不加模板DNA或RNA,进行PCR扩增，以监测试剂是否污染。
3、重复性试验。
4、选择不同区域的引物进行PCR扩增。
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