免l疫印迹和检测（所有步骤均在室温下搅拌）
1.在电印迹步骤之后，将PVDF膜浸入100％甲l醇中15秒钟，然后使其在室温下干燥5分钟。注意：如果使用硝l酸纤维素代替PVDF，则应跳过此步骤。
2.在室温下不断搅拌下，在TBST中用5％脱脂奶粉或3％BSA封闭膜1小时。
将膜与抗Arf 6兔多克l隆抗l体在5％脱脂奶粉或3％BSA
Ran-GTP
免l疫印迹和检测（所有步骤均在室温下搅拌）
1.在电印迹步骤之后，将PVDF膜浸入100％甲l醇中15秒钟，然后使其在室温下干燥5分钟。
注意：如果使用硝l酸纤维素代替PVDF，则应跳过此步骤。
2.在室温下不断搅拌下，在TBST中用5％脱脂奶粉或3％BSA封闭膜1小时。
将膜与抗Arf 6兔多克l隆抗l体在5％脱脂奶粉或3％BSA / TBST中以1：501000（取决于样品中Arf 6蛋白质的量）新鲜稀释，孵育1-在室温下持续搅拌2小时或
过夜4oC。
3.用TBST将印迹的膜清洗3次，每次5分钟。
4.将膜与二抗（例如山羊抗兔IgG，HRP偶联物）一起孵育，在室温下以恒定的比例在5％脱脂奶粉或3％BSA / TBST中以1：1000的比例新鲜稀释。搅动。
5.用TBST将印迹的膜清洗3次，每次5分钟。
6.使用您选择的检测方法，例如ECL。
电泳和转膜
1. 取15ul样品/孔上样17%配体胶。
2. 按照制造商的说明进行SDS-PAGE。
3. 按照制造商的说明将凝胶蛋白转到PVDF或硝化纤l维素膜。
免l疫印迹反应和检测（所有步骤都是在室温下进行，并不断搅拌）
1. 将PVDF膜浸入甲l醇15s，然后在室温放置5 min晾干。
注意：如果使用的是硝化纤l维素膜，此步省略。
2. 封闭：用TBST缓冲液配制5%的脱脂牛奶或者3%BSA在室温下孵育1H进行封闭，并需要恒定振荡。
3. 孵育一抗：用TBST缓冲液配制的5%脱脂牛奶或3%BSA稀释特异性识别Cdc42活性构象的兔多克l隆抗l体（稀释比例为1:50-1:1000，主要根据样品中含有的Cdc42蛋白的量），室温下孵育1-2小时，或者4°C条件下过夜孵育。
4. 用TBST缓冲液洗涤膜三次/5min。
5. 孵育二抗：（例如羊抗兔IgG-HRP），用TBST缓冲液配制的5%脱脂牛奶或3%BSA按1:1000稀释比例稀释后使用，室温下孵育1小时并恒定振荡。
6. 用TBST缓冲液洗涤膜三次/5min。
7. 使用实验者所选择的检测方法进行显色如ECL显色法。
分析原理
NewEast Biosciences Arl1激l活检测试剂盒基于配置特异性抗Arl1-GTP
从细胞提取物或体外检测活性Arl1-GTP水平的单克l隆抗l体GTPγS负载Arl1活化分析。简而言之，抗活性Arl1小鼠单克l隆抗l体将用含有Arl1-GTP的细胞裂解液培养。然后，绑定的活动Arl1将被下拉蛋白质A/G琼脂糖。用抗Arl1兔多克l隆抗l体或抗Arl1小鼠单克l隆抗l体进行免l疫印迹分析，检测沉淀的活性Arl1。
需要但未提供的材料
1刺激性和非刺激性细胞裂解物
2蛋白酶抑制素
4°C摇管器或振动筛
40.5 M EDTA，pH8.0
51百万氯化镁
62X还原SDS-PAGE样品缓冲液
7电泳和免l疫印迹系统
8免l疫印迹洗涤缓冲液，如TBST（10 mM Tris HCl，pH 7.4，0.15 M NaCl，0.05%
吐温-20）
9免l疫印迹阻断缓冲液（含5%脱脂奶粉或3%牛血l清白蛋白的TBST）
10PVDF或硝化纤维膜
11次级抗l体
12ECL检测试剂
电泳和转移
1向聚丙l烯酰胺凝胶（17%）中加入15μL/孔的下拉上清液。而且
建议包括预染色MW标准（作为成功转入的指标步骤3）。
2按照制造商的说明进行SDS-PAGE。
3按照制造商的说明，将凝胶蛋白转移到PVDF或硝化纤维膜上
说明。
免l疫印迹检测（所有步骤均在室温下搅拌）
1在电印迹步骤之后，将PVDF膜浸入甲l醇中15次
然后在室温下干燥5分钟。
如果使用硝基纤维素，则应跳过此步骤。
2室温下用5%脱脂奶粉或3%牛血l清白蛋白在TBST中封闭1小时
不断地搅动。
用抗Arl1单克l隆
