DNA测序检测
1. PCR测序反应
(1)取0.2ml的PCR管，用记号笔编号，将管插在颗粒冰中，按下表加试剂:
所加试剂测定模板管标准对照管
BigDye Mix
1μl
待测的质粒DNA
1μ 1
pGEM-3Zf (+)双链DNA
-1μ1
待测DNA的正向引物
M13(-21)引物- 1μ 1
灭
fish检测
DNA测序检测
1. PCR测序反应
(1)取0.2ml的PCR管，用记号笔编号，将管插在颗粒冰中，按下表加试剂:
所加试剂测定模板管标准对照管
BigDye Mix
1μl
待测的质粒DNA
1μ 1
pGEM-3Zf (+)双链DNA
-1μ1
待测DNA的正向引物
M13(-21)引物- 1μ 1
灭菌去离子水
2μ 1
总反应体积5μ 1,不加轻矿物油或石蜡油，盖紧PCR管，用手指弹管混匀，稍离心。
(2)将PCR管置于9600或2400型PCR仪.上进行扩增。98C变性2min后进行PCR循环，
PCR循环参数为96C 10s， 50C 5s， 60°C4min， 25 个循环，扩增结束后设置4C保温。
2.乙醇法纯化PCR产物
(1) 将混合物离心，将扩增产物转移到1.5ml EP管中。
(2)加入25μ 1/乙醇混合液，充分振荡，置冰上10min以沉淀DNA。12 000r/min于
4C离心30 min,小心弃上清。
(3)加70%(V/V)的乙醇50μ 1 洗涤沉淀2次。12 000r/min 于4C离心5min,小心弃上清和
管壁的液珠，真空干燥沉淀10~ 15min。
3.电泳前测序PCR产物的处理。
(1)加入12μ 1的TSR于离心管中，剧烈振荡，让其充分溶解DNA沉淀，稍离心。
(2)将溶液转移至盖体分离的0.2ml PCR管中，稍离心。
(3)在PCR仪上进行热变性(95C 2min),冰中骤冷，待_上机。
4..上机操作按仪器操作说明书安装毛细管，进行毛细管位置的校正，人工手动灌胶和建立
运行的测序顺序文件。
5.仪器将自动进行序列分析，并可根据用户要求进行序列比较。如测序序列已知，可通过
序列比较以星号标出差异碱基处，提高工作效率。
6.测序完毕按仪器操作规程进行仪器清洗与保养。
转录组重测序
转录组测序的研究对象为特定细胞在某一功能状态下所能转录出来的所有mRNA的总和。转录组研究是基因功能及基因结构等研究的基础，通过新一代高通量测序，能够的获得某一物种特定组织或在某一状态下的几乎所有转录本序列信息，已广泛应用于临床诊断、基础研究和研发等领域。而安捷伦和Illumina的探针能够在低密度下捕获更多数量的变异。
转录组Resequencing针对的是有参考基因组的物种。用新一代高通量测序技术对某物种的特定组织或细胞进行转录组测序，与参考基因组比较，可以得到基因表达差异、可变剪接、融合基因等遗传调控信息。
染色质免l疫共沉淀技术(ChIP)
基于体内分析而发展的染色质免l疫沉淀分析Chr omat in immunoprecipitat ionassay kit, ChIP)技术可以真实、完整地反映结合在DNA序列上的调控蛋白。由于ChIP采用甲醛固定活l细胞或者组织的方法，因此能比较真实的反映细胞内TF与Promoter的结合情况，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。近年来,这种技术得到不断的发展和完善。转录组测序（RNA-Seq）是指利用第二代高通量测序技术进行cDNA测序，地获取某一物种特定qi官或组织在某一状态下的转录本。采用结合微阵列技术在染色体基因表达调控区域检查染色体活性,是深入分析癌l症、心血l管病以及神经系统紊乱等疾病主要通路的一-种非常有效的工具。
染色质免l疫沉淀分析(ChIP) 的基本原理是在活l细胞状态下，当用甲醛处理时，相互靠近的蛋白与蛋白、蛋白与核酸(DNA或RNA)之间会产生共价键。细胞内，当F与Promoter相互结合时，它们必然靠的比较近或者契合在一起，这个时候用甲醛处理，能使它们之间产生共价键。固定的蛋白质DNA复合物通过超声或酶处理将其随机切断为-定长度范围内的染色质小片段然后通过抗原抗l体的特异性识别反应沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNAl片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。12000r/min于4C离心5min,小心弃上清和管壁的液珠，真空干燥沉淀10~15min。通过qPCR或二代测序，筛选与目的蛋白互作的未知DNA信息。
注意事项
1. 为了避免蛋白质变性，不要对样品剧烈搅动和反复冻融。
2. 缓冲溶液成分尽量模拟细胞内环。。
3. 为了避免蛋白质的氧化，将 0.1～1 mmol/LDTT（二硫苏糖醇）(或 β-巯）加入到缓冲溶液中。
4. 为了避免重金属对目标蛋白的破坏，将 1～10 mmol/LEDTA 金属螯合剂加入。
5. 为了避免微生物生长，使用灭菌溶液。在纯化任何一种蛋白质的时候，均必须时刻对它的稳定性注意维护，使它的活性得到保护，需要牢记如下一些通用的注意事项。
6. 尽可能置于冰上或者在冷库内进行操作。
7. 蛋白浓度不要太稀。
8. 除非是进行聚焦层。否则 pH 需要合适，防止所使用的缓冲溶液 pH 与 pI 相同，使蛋白质的沉淀得以避免。
9. 使用蛋白酶，避免蛋白酶对目标蛋白的降解；在纯化细胞中的蛋白质时，将 DNA 酶加入来使得 DNA 降解，避免 DNA 对蛋白的污染。
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