软琼脂培养克l隆形成试验基本步骤:
(1)取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，作活l细胞计数，用含20%胎牛血l清的DMEM培养液调整细胞密度至1x106细胞/L。然后根据实验要求作梯度倍数稀释。
(2)用蒸馏水分别制备出1.2%和0.7%两个浓度的低溶点琼脂糖液，高压灭菌后，维持在40日中不会凝固。
(3)按1:1比例使1.
流式细胞
软琼脂培养克l隆形成试验基本步骤:
(1)取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，作活l细胞计数，用含20%胎牛血l清的DMEM培养液调整细胞密度至1x106细胞/L。然后根据实验要求作梯度倍数稀释。
(2)用蒸馏水分别制备出1.2%和0.7%两个浓度的低溶点琼脂糖液，高压灭菌后，维持在40日中不会凝固。
(3)按1:1比例使1.2%的琼脂糖和2xDMEM培养基(含有2x和20%的小牛血l清)混合后，取3mL混合液注入直径6cm平皿中(10cm平皿加7~ 10mL)，冷却凝固，可作底层琼脂置CO2温箱中备用。
(4)按1:1比例让0.7%的琼脂糖和2xDMEM培养基在无菌试管中相混以后，再向管中加入0.2mL的细胞悬液，充分混匀，注入铺有1.2%琼脂糖底层平皿中，逐形成双琼脂层。待上层琼脂凝固后，置入37回5%CO2温箱中培养10~14天。
(5)把平皿放置在倒置显微镜下，观察细胞数。一般流程：细胞接种培养-划痕-不同时间点拍照细胞迁移和侵袭实验是体外模拟细胞迁移和侵袭能力的检测方法。计算形成率。软琼脂培养法常用检测肿l瘤细胞和转化细胞系。试验中琼脂与细胞相混时，琼脂温度不宜超过40日。接种细胞的密度每平方厘米不超过35个，一般6cm的平皿接种1000个细胞。正常细胞在悬浮状态下不能增殖，不适用于软琼脂克l隆形成试验。
软琼脂集落形成率实验(软琼脂克l隆)
将1.2%低熔点琼脂糖与2x细胞培养基以1:1的体积比混合制备0.6%的底层琼脂，6孔板中每个孔1.4ml温室凝固，取对数期细胞，胰酶消化后吹散成单个细胞悬液，计数，并调细胞浓度为10000个/ml，将0.6%低熔点琼脂糖与2x细胞培养基以1:1的体积比混合，制备0.3%的上层琼脂，每孔加1ml 上层琼脂和100ul单细胞悬液(约1000ell/wel)， 混匀，室温凝固。虽然3D多细胞肿liu球模型具有更显著的实体肿liu生理相关性，但是与2D贴壁细胞培养模型相比，获得大量相对统一的3D多细胞肿liu球模型需要-系列的培养过程和表征手段。置于37目，5%CO2的细胞培养箱中培养2-3周，计数含50个细胞以上得克l隆，计算细胞集落形成率，Spotll 采集图像。
细胞培养中常见的污染及解决方法
原生动物污染
原生动物污染后，细胞培养基变得轻微浑浊。血管生成（Angiogenesis）是指源于已存在的mao细血管和毛xi血管后微静脉新的mao细血管性血管的生长。在显微镜下，大量的小点来回移动。虽然此时细胞仍能生长，但繁殖速度减慢，细胞生长状态不好，边缘不清，变得不透明。原生动物与细胞形成共生关系。同时，原生动物与细胞竞争营养。这种共生现象非常普遍，但以细胞为主，因为原生动物的数量相对较少，因而对细胞的正常生长没有影响，只有当它们达到一定数量时，才终爆发成为循环。
解决方法：原生动物污染的原因有很多，如液体消毒问题、操作问题、环境问题等，如果细胞足够，果断丢弃被污染的细胞和复苏细胞。如果要保留，需要购买使用相关的灭菌试剂。
选择实验外包公司需要注意哪些事项？
技术支持
尽量有专门的技术负责对接项目，或者有技术服务群。随时沟通项目问题，定期汇报实验进展。这样能把控实验进度，结果数据有疑问也可以交流，不要实验做完就没人管了。
实验数据
明确提供实验原始数据、原始图片，并有保密协议不外传数据和客户的信息。去除髓质后将皮质剪成约1-2mm'的碎块，轻碾shen皮质依次通过80。确保实验结果的完整性、唯独性、真实性。这也是找实验外包很关心的原则。另外结果尽量有实验报告形式，包含所用材料、实验步骤和结果统计分析，方便写文章时直接使用。另外实验都是有不确定性的，如果外包公司能保证一定能做出预期的结果，那多半是不靠谱的。做实验不怕出问题，的外包公司会负责到底，有问题反馈再处理就好。
大鼠脂肪的分离
将手术切取的大鼠脂肪组织尽量剪碎后移至离心管，其余步骤与人脂肪的分离一致。
经手术切除获得的大鼠皮下脂肪组织消化后原代培养24 h，且肉眼观察会发现培养瓶底部贴附着一层网状薄膜，轻轻摇晃培养瓶可使这层网状薄膜从瓶壁上脱落，镜下观 察发现大部分细胞都附着于这层膜上，通过术获取的人脂肪组织消化后则无此现象。5ml生物素化抗ti（Bio-Ab）（2μg/ml），37℃孵育1h或4℃过夜，弃掉液体，PBS-T洗涤3次，每次3min。增加胶原酶的量和消化时间也无法避免，取材时的或脂肪间结缔组织未被完全消化，穿过细胞筛进入了培养瓶并沉淀于瓶底部形成的。胶原蛋白酶虽然可以特异性水解胶原蛋白的三维螺旋结构，但不会损伤其他蛋白质。处理方法是37 ℃下用胰蛋白酶 消化5 min。然后利用40 μm的细胞筛过滤后传代。 根据作者的经验，每毫升手术切除的大鼠脂肪可分离基质血管成分细胞约1.81×106个。原代培养2.24×10^7个大鼠基质血管成分细胞，40 h后传代时约剩余 6.2×10^6个细胞，细胞剩余率27%。
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