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如何用制备色谱柱制备低含量的杂质？

制备色谱柱为ZorbaxSB-C18 9.4*250mm及gilson馏分收集器，色谱仪为Agilent1100或LC-6A。想用其制备面积归一化法含量为0.05%左右的杂质，初步提纯后用高分辨的LC-MS进行定性分析。如何设定色谱条件，如，流量、进样量、样品的浓度、切割点的设置、是否要浓缩，要求将95%以上的主峰切除。

（主峰后有二个杂质靠得很近。）

答：

1.制备用的流动相尽量等级高一点，否则流动相中的杂质会影响LC-MS分析。

2.使用馏分收集器时，延迟体积一定要计算准确，检测器的响应时间设到很小，否则都会影响收集的纯度和回收率。制备柱的流速一般与直径的平方成正比，如果4.6mm分析柱流速为1mL/min，9.4mm制备柱用1*（9.4/4.6）2,大约为4mL/min。进样量设到几个mg应该基本没有过载。进样样品浓度越高越好。假如进样10mg，理论计算0.05%的杂质大约只有5μg，显然浓度太低，尽量是多做几次，合并馏分然后浓缩后做LC-MS分析。

工业制备色谱

蛋白质的特定构象对蛋白质的生物功能起决定性的作用。而几乎所有的蛋白质必须与其他分子相结合才能发挥其功能和作用。当蛋白质的构象发生变化，例如通过加热或化学试剂处理等使多肽链的盘绕和折叠被解开，其空间结构发生变化， 则蛋白 质变性， 其功能和生物活性即丧失，作为现代生物科技的主要产品类型，蛋白质是结构和功能非常复杂的大分子。

流动相

HPLC中使用的流动相是液体，而在气相色谱法中则是气体。由于液体的密度和粘度较高，因此要使用泵来给流动相推动压力通过HPLC色谱柱，因此液相色谱的背压通常很高，比如超高压液相色谱。背压太高会对液相系统造成负担，因此适当的控制在合适的压力程度，有助于我们分析测试的正常运行。恒谱生的液相色谱柱、保护柱、在线过滤器等都能做到低背压，死体积小，避免对分析结果造成影响。

氧化铝基质的基本特点

氧化铝基质的一大特点是结构稳定，既可呈酸性，又可呈碱性。其次，铝元素在自然界含量丰富，仅次于氧元素和硅元素。在实际应用中，色谱用氧化铝填料主要应用于正相色谱、反相色谱和离子交换色谱。对于一些不饱和化合物，特别是芳香族化合物的保留效果较佳，有时还可用于分离芳烃类异构体。除此之外，氧化铝基质的pH耐受范围在3-12，可用于分离碱性化合物。以上这些特点使得氧化铝在某些领域能与硅胶形成良好的互补作用。