神经元原代培养是将胚胎哺乳动物神经系统的部分组织,如大脑皮层、海马、脊髓等脑组织直接取出,再接种培养的方法。目前国内、外有关神经元培养的方法较多,但在原代培养中神经元的纯度和产量方面还存在一些急待解决的问题。由于神经元是一种高度分化的细胞,相对于其它细胞而言,神经元在体外更难以存活和生长。因此,体外培养神经元要求的培养方法和营养条件均较为特殊。
神经细胞的体外培养技术是研
动物尿液检测
神经元原代培养是将胚胎哺乳动物神经系统的部分组织,如大脑皮层、海马、脊髓等脑组织直接取出,再接种培养的方法。目前国内、外有关神经元培养的方法较多,但在原代培养中神经元的纯度和产量方面还存在一些急待解决的问题。由于神经元是一种高度分化的细胞,相对于其它细胞而言,神经元在体外更难以存活和生长。因此,体外培养神经元要求的培养方法和营养条件均较为特殊。
神经细胞的体外培养技术是研究神经源性疾病的发病机制、进程的一个重要工具,能很好的、直观的反映离体神经元的发育状况和生理活性,如何建立一个稳定成熟的神经细胞培养体系是神经系统疾病体外实验研究顺利进行的基础。随着基础医学及临床医学研究的逐渐深入,神经细胞的体外培养技术在脑损伤、神经疾病、衰老相关神经疾病方面得到广泛重视和普及应用。
(1)75% (体积分数)酒精消毒孕鼠,在无菌条件下取出胎鼠,分离并切取脊髓,置于冷的无钙、镁的HBSS液的平皿中( 下置冰袋)。
(2)解剖显微镜无菌条件下仔细剥离脊膜及血管。
(3)用弹簧剪将脊髓剪成1cm3大小,消化液37℃消化15-20min,每五分钟振荡一次;
(4)去掉上清,加入终止液终止消化,吹打10-15次,不能有气泡,收集上清,剩余组织再消化一次。
(5)4℃1000rpm离心10min,弃上清,加入种植液1重悬,培养箱内差速贴壁30min;
(6)收集上清,台盼蓝染色计数,按6*105cells/孔种入六孔板(种植液1),37℃,5%CO2,95%饱和湿度的培养箱中培养;
(7)培养第二天,全换液更换为种植液2;
(8)培养第四天,半量换液加入5uM的,24h全量换液;
(9)之后每周换液两次。
SSC=150mMNaCl,15mM柠檬酸钠溶液(pH7.4)
HCl处理:对样本进行20-30min的200mMHCl处理,可将蛋白抽提,并将核酸序列进行一定程度的水解,增加杂交检测的信噪比。
去垢剂处理:如果对样品的固定、脱水、包埋等预处理过程不足以将脂膜成分破坏暴露核酸,可对样品进行额外的蛋白去垢剂处理(如TritonX-100和SDS)。
蛋白酶处理:样品中待杂交的核酸序列常与蛋白缠绕交联在一起,样品的固定步骤更是加剧了蛋白的交联程度,因此预渗透是核酸杂交前的常规步骤,通常通过蛋白酶K的消化作用来完成。根据不同的文献来源,蛋白酶K的工作浓度通常设为10-500μg/ml(溶解于20mMTris-HCl,2mMCaCl2,pH7.4,酶浓度可根据具体样品进一步优化),对样品进行37°C7.5–30min的处理。染色体涂片或核片的蛋白酶K处理浓度可降至1μg/ml消化7.5min。也有文献指出,固定石蜡包埋的组织切片样品,使用胃蛋白酶(500μg/ml,溶于200mMHCl)将得到较好的蛋白消化结果。

动物实验发展的目的,就是要通过对动物本身生命现象的研究,进而推用到人类,探索人类的生命奥秘,控制人类的疾病和衰老,延长人类的寿命。随着医学生物科学的突飞猛进发展,认识到公害问题不仅已成为粮食、人口、老年人等的重大社会问题,而且还涉及到地球上生活着的动物生存问题,例如产业公害、食品公害、药品毒性等,均直接影响人体健康,对这些问题的研究,必然要通过动物实验(包括动物疾病模型的开发等)来阐明解决。因此,实验动物科学,特别是实验动物的重要性愈来愈被人们所认识,它已被认为是人类追求幸福生活的支柱,故实验动物科学亦被称之为生命科学;为此,对实验动物科学的发展,均给给予高度的重视,其投入的经济物资和技术力量,几乎可同发展原子能科学相提并论,其重要意义可想而知。

(作者: 来源:)