透射电镜自噬小体检测
胰酶消化，收集作用后的细胞，离心，先将细胞块固定在2.5%成二醛和0.1%的PBS溶液中保存在4C中过夜。
再用乙醇梯度脱水，接下来用环氧树脂浸透并切成薄片。随后超薄切片用铜网固定，后用重金属醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色。通过TEM分析凋亡细胞内超微结构变化，拍照保存。
贴壁细胞:先倒出培养液，采用胰蛋白酶消化或者用细胞刮(会产生碎屑
细胞实验外包费用
透射电镜自噬小体检测
胰酶消化，收集作用后的细胞，离心，先将细胞块固定在2.5%成二醛和0.1%的PBS溶液中保存在4C中过夜。
再用乙醇梯度脱水，接下来用环氧树脂浸透并切成薄片。随后超薄切片用铜网固定，后用重金属醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色。通过TEM分析凋亡细胞内超微结构变化，拍照保存。
贴壁细胞:先倒出培养液，采用胰蛋白酶消化或者用细胞刮(会产生碎屑)刮下:带培养液进行离心，100-1500/mim 5 10min。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿liu药wu筛选、细胞毒性试验、以及肿liu放she敏感性测定等。离心完毕倒出培养液。管底的细胞团不要打散， 沿管壁倒入适量(一般为材料体积的5-10倍)的2.5-3.5%成醒固定液，固定约1h-2h. 也可在4C冰箱过夜。
干细bao培养诱导分化
干细bao是一类具有自我更新、高度增殖和多项分化潜能的细胞，理论上具有分裂能力，在特定条件下，可分化成特定组织。细胞筛选好后，使用定量PCR和Westernblot检测目的基因的稳定表达情况。通常改变抑制 ES 细胞不分化状态的培养条件, ES 细胞就可以分化成多种细胞类型。ES 细胞具有的这种能力在体外增殖并保持未分化状态及其多向分化潜能的生物学特性,使其广泛应用于生物学研究的各个领域, 它的潜在医学应用价值已成为世界范围内研究的热点。目前，已报道的自ES细胞诱导分化的细胞主要包括胰岛细胞、造血细胞、肝细胞、神经细胞、脂肪细胞、心肌细胞、内皮细胞、上皮细胞、成骨细胞、软gu细胞和黑素细胞等。
三、自噬过程进行观察和检测
1、观察自噬体的形成
由于自噬体属于亚细胞结构，普通光镜下看不到，因此，直接观察自噬体需在透射电镜下。单丹磺酰尸胺(Dansylcadaverine,MDC是一种荧光色素，是嗜酸性染色剂，通常被于检测自噬体形成的特异性标记染色剂,其检测激发滤光片波长355nm,阻断滤光片波长512nm。Phagophore的特征为:新月状或杯状，双层或多层膜,有包绕胞浆成分的趋势。自噬体(AV1 )的特征为:双层或多层膜的液泡状结构，内含胞浆成分，如线粒体、内质网、核糖体等。自噬溶酶体(AV2 )的特征为:单层膜，胞浆成分己降解。( autophagic vacuolo AV )
2、在荧光显微镜下采用GFP-LC3融合蛋 白来示踪自噬形成由于电镜耗时长，不利于监测(Monitoring) 自噬形成，人们利用LC3在自噬形成过程中发生聚集的现象开发出了此技术。接种细胞的密度每平方厘米不超过35个，一般6cm的平皿接种1000个细胞。无自噬时，GFP-LC3融合蛋 白弥散在胞浆中;自噬形成时，GFP-LC3融合蛋白转 位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体，可以通过计数来评价自噬活性的高低。
3、利用Western Blot检测LC3-II/比值的变化以评价自噬形成自噬形成时，胞浆型LC3 (即 LC3-I)会酶解掉一小段多肽，转变为(自噬体)膜型(即LC3-ID，因此，LC3-II/比值 的大小可估计自噬水平的高低。用200μ的移液枪反复、地吹打平皿中的液体，转移至15ml离心管中，于4C1500rpm离心5分钟，倒掉上清，以10ml胰酶重悬沉淀，放在37C水浴中消化30分钟，且每隔五分钟轻轻晃动，使之充分消化。(注意: LC3对LC3-II有更高的亲和力，会造成假阳性。方法2和3需结合使用，同时需考虑溶酶体活性的影响。)
4、MDC (Monodansylcadaverine ，单丹磺酰尸胺)染色:包括自噬体，所有酸性液泡都被染色，故属于非特异性的。
5、CellTrackerTM Green染色:主要用于双染色，但其能染所有的液泡，故也属于非特异性的。
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