细胞ELISPOT检测
1．培养板的预处理：在24孔培养板内加0.5ml 0.2%戊er醛，37℃，4h，弃掉板中的处理液，用PBS洗涤3次，每次3min；
2．抗原包被：将适量抗原溶于包被缓冲液中，每孔加入0.5ml，4℃过夜，PBS-T洗涤3次，每次3min；
3．制备细胞悬液：将待测已致敏小鼠处死，取出pi脏，置于加有
流式细胞技术
细胞ELISPOT检测
1．培养板的预处理：在24孔培养板内加0.5ml 0.2%戊er醛，37℃，4h，弃掉板中的处理液，用PBS洗涤3次，每次3min；
2．抗原包被：将适量抗原溶于包被缓冲液中，每孔加入0.5ml，4℃过夜，PBS-T洗涤3次，每次3min；
3．制备细胞悬液：将待测已致敏小鼠处死，取出pi脏，置于加有Hanks液的平皿内，用钝头直角9号zhu射器针头破少许脾被膜后，赶出细胞，用毛细吸管轻轻吹散细胞团后，将悬液通过250目尼龙网，取滤液，1000r/min离心5min，Hanks液洗涤3次，计数细胞后，用1640液重新悬浮细胞，配成所需浓度；2、将细胞悬液作梯度倍数稀释，每组细胞分别以每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10mL37预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。
4．往各孔中加入0.5ml含不同浓度（104-106/ml）的细胞悬液，置37℃，5％CO2条件下孵育2-4h，弃掉培养液，PBS-T洗涤3次，每次3min；
5．往各孔中加入0.5ml生物素化抗ti（Bio-Ab）（2μg/ml），37℃孵育1h或4℃过夜，弃掉液体，PBS-T洗涤3次，每次3min；
6．加入辣根过氧化物酶结合的亲合素（Avi-HRP）（2μg/ml），37℃孵育30min，弃掉液体，PBS-T洗涤3次，每次3min；
7．配制明胶-底物液：在37℃水浴中，将2.5mlTMB溶液（4mg/ml jia醇溶液）滴加入7.5ml10%明胶溶液（用pH5.0磷酸钠-柠檬酸缓冲液配制）边加边搅，溶液呈白色，加入14μl 3% H202；
8．显色与计数：将培养板底冰浴，每孔加入0.6ml明胶-底物液，约3min，混合液凝固，将培养板取出，置室温5min，将板倒置，用肉眼和低倍放大镜计数所显示出的颜色的斑点。
三、自噬过程进行观察和检测
1、观察自噬体的形成
由于自噬体属于亚细胞结构，普通光镜下看不到，因此，直接观察自噬体需在透射电镜下。Phagophore的特征为:新月状或杯状，双层或多层膜,有包绕胞浆成分的趋势。自噬体(AV1 )的特征为:双层或多层膜的液泡状结构，内含胞浆成分，如线粒体、内质网、核糖体等。自噬溶酶体(AV2 )的特征为:单层膜，胞浆成分己降解。虽然3D多细胞肿liu球模型具有更显著的实体肿liu生理相关性，但是与2D贴壁细胞培养模型相比，获得大量相对统一的3D多细胞肿liu球模型需要-系列的培养过程和表征手段。( autophagic vacuolo AV )
2、在荧光显微镜下采用GFP-LC3融合蛋 白来示踪自噬形成由于电镜耗时长，不利于监测(Monitoring) 自噬形成，人们利用LC3在自噬形成过程中发生聚集的现象开发出了此技术。无自噬时，GFP-LC3融合蛋 白弥散在胞浆中;自噬形成时，GFP-LC3融合蛋白转 位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体，可以通过计数来评价自噬活性的高低。LeageneMDC染色液适用于培养细胞的自噬染色，可与EB合用双染。
3、利用Western Blot检测LC3-II/比值的变化以评价自噬形成自噬形成时，胞浆型LC3 (即 LC3-I)会酶解掉一小段多肽，转变为(自噬体)膜型(即LC3-ID，因此，LC3-II/比值 的大小可估计自噬水平的高低。(注意: LC3对LC3-II有更高的亲和力，会造成假阳性。方法2和3需结合使用，同时需考虑溶酶体活性的影响。从而使得研发或生产者不必以杂交瘤细胞为载体保留该，而可以以碱基序列的形式进行保存和传播交流、鉴定。)
4、MDC (Monodansylcadaverine ，单丹磺酰尸胺)染色:包括自噬体，所有酸性液泡都被染色，故属于非特异性的。
5、CellTrackerTM Green染色:主要用于双染色，但其能染所有的液泡，故也属于非特异性的。
选择实验外包公司需要注意哪些事项？
1. 实地考察
可以到公司实地考察一下实验室，看一下实验室环境、设备仪器情况，是否能满足实验方案所需条件。能整体承接课题，动物细胞。一些大型仪器公司不一定有，看有没有高校平台资源渠道共享。确保是真实进行实验的，这样后续实验结果数据也比较可靠。
2. 方案评估
实验合作前期一般会进行所需实验内容的评估，来确定终实际实验方案和报价。方案评估可以看出外包团队的性。一个可靠的外包公司会对方案提出针对性的建议，评估各项实验是否能做，以及根据预算情况和实际操作对细节适当地调整。任何实验都是有不确定性的，但是前期敲定好方案能为后续实际开展实验打下良好基础，也会省去许多隐患和麻烦。3D细胞培养3D多细胞肿liu球是在体外应用组织培养方法使肿liu细胞以多细胞集聚体的形式生长成为具有三维结构的球体。
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