原位杂交涉及的步骤:玻片的准备和样品固定,细胞或组织的预渗透处理,靶DNA变性(DNA原位杂交),探针制备,原位杂交过程,杂交后洗涤,探针(显色)检测。
玻片的准备和样品固定
对于染色体涂片,1:1的乙醇/醚处理的载玻片已能符合要求。对于组织切片的原位杂交,为了在实验过程中不丢失组织样品,可使用多聚赖氨酸或铬矾明胶包被的载玻片。
样品的固定步骤是
动物尿液检测
原位杂交涉及的步骤:玻片的准备和样品固定,细胞或组织的预渗透处理,靶DNA变性(DNA原位杂交),探针制备,原位杂交过程,杂交后洗涤,探针(显色)检测。
玻片的准备和样品固定
对于染色体涂片,1:1的乙醇/醚处理的载玻片已能符合要求。对于组织切片的原位杂交,为了在实验过程中不丢失组织样品,可使用多聚赖氨酸或铬矾明胶包被的载玻片。
样品的固定步骤是为了保持样品的原有形态学。样品固定是原位杂交中的步骤,从化学反应角度来看,固定剂的使用和选择对后续杂交的影响不会太大,因为核酸杂交的功能分子基团被安全地包裹在DNA双螺旋结构中,而交联剂的使用对RNA基本没有影响。对于染色体涂片,常使用/固定;石蜡包埋的组织切片用固定。冷冻切片可通过在4%的甲醛溶液中固定30min,或使用Bouin固定剂。
SSC=150mMNaCl,15mM柠檬酸钠溶液(pH7.4)
HCl处理:对样本进行20-30min的200mMHCl处理,可将蛋白抽提,并将核酸序列进行一定程度的水解,增加杂交检测的信噪比。
去垢剂处理:如果对样品的固定、脱水、包埋等预处理过程不足以将脂膜成分破坏暴露核酸,可对样品进行额外的蛋白去垢剂处理(如TritonX-100和SDS)。
蛋白酶处理:样品中待杂交的核酸序列常与蛋白缠绕交联在一起,样品的固定步骤更是加剧了蛋白的交联程度,因此预渗透是核酸杂交前的常规步骤,通常通过蛋白酶K的消化作用来完成。根据不同的文献来源,蛋白酶K的工作浓度通常设为10-500μg/ml(溶解于20mMTris-HCl,2mMCaCl2,pH7.4,酶浓度可根据具体样品进一步优化),对样品进行37°C7.5–30min的处理。染色体涂片或核片的蛋白酶K处理浓度可降至1μg/ml消化7.5min。也有文献指出,固定石蜡包埋的组织切片样品,使用胃蛋白酶(500μg/ml,溶于200mMHCl)将得到较好的蛋白消化结果。

它是伴随着生物医学科学,通过漫长的动物实验过程形成的。但是,实验动物科学的迅速发展,使得实验动物的研究价值已经不于生物科学方面,而且广泛地与许多领域科学实验研究紧紧地联系在一起,成为保证现代科学实验研究的一个的条件。在很多领域的科学研究中,实验动物充当着非常重要的安全试验,效果试验、标准试验的角色。
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